酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用

張小飄綜述,聶 明審校

(湖北省襄樊市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 441000）

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)的長(zhǎng)處,能夠分析經(jīng)特異抗原活化后分泌細(xì)胞因子[如干擾素-γ(interferongamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等]的單個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的頻數(shù),具有敏感、特異、易于重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)[1],是檢測(cè)抗原反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞的最可靠實(shí)驗(yàn)方法之一[2],目前已成為抗原特異性T細(xì)胞免疫學(xué)研究的主流技術(shù)。本文就ELISPOT技術(shù)作如下綜述。

1 ELISPOT技術(shù)的基本原理

ELISPOT培養(yǎng)板以二氟化樹(shù)脂(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜等為基質(zhì),包被上特異性單克隆抗體,在培養(yǎng)板孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基、待檢測(cè)的細(xì)胞及抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。在特異性抗原或非特異性有絲分裂原的刺激下,T細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子,細(xì)胞因子被膜上的單克隆抗體捕獲。被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,然后用酶標(biāo)親和素與生物素進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色,在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形斑點(diǎn)[3]。

2 ELISPOT技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

ELISPOT技術(shù)得到廣泛應(yīng)用,首先是由于其在檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞低頻數(shù)時(shí)的高敏感性,比以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的技術(shù)(四聚體和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色)的敏感性要高1～2個(gè)數(shù)量級(jí);其次,ELISPOT技術(shù)可以利用凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral b lood mononuclear cells,PBMC)樣本來(lái)進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)分析而不喪失細(xì)胞的重要活性[4],同時(shí)計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)的使用也使大規(guī)模研究成為可能。

3 ELISPOT技術(shù)的分析方法

由于IFN-γ分泌量較多,且與T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能密切相關(guān),使IFN-γ的ELISPOT技術(shù)分析得到了廣泛應(yīng)用[5]。但是,單獨(dú)檢測(cè)IFN-γ不足以充分反映T細(xì)胞的免疫功能,同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子的需求使雙色ELISPOT、熒光ELISPOT及Granzyme B ELISPOT等分析方法相繼出現(xiàn)[6-8]。但這些方法還需進(jìn)一步完善,雖然早已有雙色ELISPOT技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道,但一些原因卻限制了其廣泛使用。(1)當(dāng)ELISPOT板包被時(shí),2種捕獲抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到膜表面,抗體的疏水性決定它們結(jié)合到膜上的親活力,如果1種抗體具有更強(qiáng)的親水性,它將喪失競(jìng)爭(zhēng)力;(2)底物產(chǎn)生的2種顏色必須各自獨(dú)立形成,不能相互干擾,且都不能處于優(yōu)勢(shì)地位,這樣產(chǎn)生2種細(xì)胞因子的細(xì)胞才能被檢測(cè)出來(lái);(3)圖像分析系統(tǒng)也必須建立起來(lái),并通過(guò)驗(yàn)證能準(zhǔn)確客觀(guān)地測(cè)量每個(gè)斑點(diǎn)的顏色和形態(tài);(4)細(xì)胞因子的產(chǎn)量還受反饋機(jī)制調(diào)節(jié)。因此,需要明確哪些細(xì)胞因子結(jié)合可以在雙色ELISPOT技術(shù)中進(jìn)行檢測(cè)。Quast等[9]發(fā)現(xiàn)白介素2(interleukin-2,IL-2)可導(dǎo)致IFN-γ和IL-5斑點(diǎn)的丟失。熒光ELISPOT技術(shù)檢測(cè)時(shí)由于熒光素直接偶聯(lián)在抗體或親和素上,缺乏酶催化底物的放大作用,靈敏度無(wú)法與化學(xué)顯色的ELISPOT技術(shù)方法比較。此外硝酸纖維素膜和PVDF膜有自發(fā)熒光現(xiàn)象,導(dǎo)致背景升高,信噪比下降[10]。

4 ELISPOT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化與驗(yàn)證

由于超高的靈敏度,ELISPOT結(jié)果易受到諸多因素影響,所以,需要進(jìn)行ELISPOT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化與驗(yàn)證[11]。

4.1 ELISPOT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

4.1.1 ELISPOT板 Schielen等[12]首先將PVDF膜應(yīng)用到ELISPOT技術(shù),后來(lái)隨著ELISPOT-免疫沉淀反應(yīng)(immunop recipitation,IP)及高通量篩選(high-throughput screening,HTS)等板材的應(yīng)用,質(zhì)量得到進(jìn)一步的提高。塑料ELISA板蛋白結(jié)合能力有限,所以不建議使用。建議在一項(xiàng)研究中使用同一種板材,最好為同一批次,同時(shí)需要檢查生產(chǎn)廠(chǎng)家的質(zhì)量控制程序,批次性能以及是否達(dá)到生物分子篩查協(xié)會(huì)(society for biomolecu lar sciences,SBS)制定的標(biāo)準(zhǔn)。

4.1.2 包被規(guī)程 使用PVDF膜板,預(yù)濕時(shí)每孔加入70%乙醇15μL以降低膜的疏水性。但乙醇必須被充分洗掉,殘留乙醇能干擾斑點(diǎn)形成。成對(duì)抗體的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而定,需要考慮抗體敏感性因素。不同商品試劑盒檢測(cè)相同細(xì)胞因子的敏感性可相差10倍,所以需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,其中的一個(gè)重要參數(shù)是包被抗體的總量,一般認(rèn)為每孔約0.5～1.0μg包被抗體可以得到理想的斑點(diǎn)。

4.1.3 細(xì)胞準(zhǔn)備 (1)細(xì)胞分離:因?yàn)榧t細(xì)胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影響T細(xì)胞功能,所以,必需進(jìn)行PBMC的分離。(2)凍存、貯藏和運(yùn)輸:凍存在細(xì)胞處理過(guò)程中最為關(guān)鍵。細(xì)胞的凍存有多種方法,自動(dòng)控制降溫器可以提供逐步智能降溫,這在細(xì)胞最佳凍存及其標(biāo)準(zhǔn)化程序中是必需的;經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法是使用裝有異丙醇的凍存盒。血液樣本處理,分離及凍存的最佳時(shí)間范圍應(yīng)該在8 h內(nèi)或在采集當(dāng)天完成,樣本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或在不合適的溫度下過(guò)久,會(huì)影響PBMC的功能,甚至可造成IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞減少5倍以上。運(yùn)輸PBMC的最佳方式是專(zhuān)用的冷凍液氮裝置,液氮緩慢揮發(fā)使氣態(tài)氮充滿(mǎn)運(yùn)輸容器,使樣本可在接近-140℃的恒定溫度下保持10～18 d。不斷變化的溫度會(huì)對(duì)細(xì)胞功能造成致命影響,不推薦用干冰運(yùn)輸盒運(yùn)送標(biāo)本。(3)細(xì)胞復(fù)蘇:細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)應(yīng)用DNA酶能提高細(xì)胞的產(chǎn)量并降低細(xì)胞團(tuán)塊形成[13],ELISPOT技術(shù)分析前最好將PBMC放置過(guò)夜,使有凋亡傾向的細(xì)胞死亡,這樣在分析前就可以估計(jì)出活力細(xì)胞的確切計(jì)數(shù)[14]。

4.1.4 刺激抗原 重組蛋白可以用來(lái)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng),對(duì)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)有限。對(duì)重組蛋白的反應(yīng)依賴(lài)于抗原呈遞細(xì)胞(antigen-p resenting cell,APC),APC細(xì)胞在凍存后數(shù)量減少,同時(shí)重組蛋白在不同貯藏溫度下會(huì)出現(xiàn)溶解性和穩(wěn)定性的問(wèn)題。活的重組病毒載體或病毒感染細(xì)胞株也有相似的優(yōu)缺點(diǎn)。重疊多肽池能用來(lái)鑒定CD4+和CD8+T細(xì)胞識(shí)別的最佳表位。肽段越短,重疊越多,鑒別組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,M HC)-Ⅰ表位時(shí)越精確,而不需要考慮可能的MHC-Ⅱ類(lèi)反應(yīng),因?yàn)镸HC-Ⅱ表位的氨基酸序列長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)。所以檢測(cè) MHC-Ⅰ表位(CD8+T細(xì)胞反應(yīng))、MHC-Ⅱ表位(CD4+T細(xì)胞反應(yīng))時(shí)在考慮合成肽價(jià)格的同時(shí)需要找到一個(gè)理想的平衡點(diǎn)。另外使用多肽時(shí)需要注意多肽的純度,以降低非特異細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

4.1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) ELISPOT技術(shù)在細(xì)胞數(shù)量上需要很高的準(zhǔn)確性,同時(shí)最小化死細(xì)胞數(shù)量也很重要,死細(xì)胞可影響分析的正確性。常用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)和對(duì)絲裂原的反應(yīng)來(lái)判斷復(fù)蘇后PBMC的質(zhì)量。但Sm ith等[15]試驗(yàn)表明檢測(cè)細(xì)胞的凋亡在判斷細(xì)胞活力方面更有效,當(dāng)?shù)蛲鲂∮?8%時(shí)可以得到理想結(jié)果。目前已有自動(dòng)化設(shè)備用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以及細(xì)胞活力檢測(cè)。

4.1.6 洗滌及斑點(diǎn)形成 洗滌程序可以采用手工,也可以使用自動(dòng)洗板機(jī)。大批量洗滌時(shí),手工需要很長(zhǎng)時(shí)間,從而造成孵育時(shí)間不一致。另外,手工洗滌時(shí),如果緩沖液過(guò)少或壓力過(guò)低就不能完全移除細(xì)胞和試劑,從而造成膜上的假相斑點(diǎn)增多以及孔的周邊顏料聚集。因此,建議使用自動(dòng)洗板機(jī),它至少可以使用2種不同的洗滌緩沖液,且能調(diào)整清洗探針的高度和緩沖液的流量。斑點(diǎn)的形成與ELISA相似,正確的成對(duì)抗體及其濃度必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后加以選擇,最佳的抗體量需要參考生產(chǎn)廠(chǎng)家的要求。對(duì)于親和素酶復(fù)合物也必須給予重視,不同批次間的酶變異性要小,以保證實(shí)驗(yàn)的可比性。底物的選擇能夠影響斑點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)量,針對(duì)同一種酶的不同底物以及不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的同一底物可能在敏感性上不同,從而造成斑點(diǎn)計(jì)數(shù)產(chǎn)生相當(dāng)大的差別[16]。

4.1.7 ELISPOT板判讀 使用顯微鏡計(jì)數(shù)斑點(diǎn)的方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,結(jié)果依賴(lài)個(gè)人經(jīng)驗(yàn),產(chǎn)生偏差和較大變異的問(wèn)題不可避免。使用自動(dòng)讀板機(jī)可明顯降低計(jì)數(shù)時(shí)的變異性[17]。Currier等[18]使用自動(dòng)讀板機(jī)時(shí)通過(guò)23個(gè) 8～11肽組成的肽池[雞胚成纖維細(xì)胞(chickenembryo fibrob last,CEF)肽池]來(lái)確定斑點(diǎn)的參數(shù)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn),它們可以被CD8+T細(xì)胞識(shí)別并被Ⅰ類(lèi)人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,H LA)-A和H LA-B等位基因呈遞,形成的斑點(diǎn)代表記憶性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。Janetzki等[19]實(shí)驗(yàn)表明使用CEF肽池的控制方法時(shí)預(yù)設(shè)讀板參數(shù)能獲得變異性更小的結(jié)果。

4.2 ELISPOT技術(shù)的驗(yàn)證 ELISPOT技術(shù)的驗(yàn)證必須在開(kāi)始臨床試驗(yàn)前進(jìn)行,驗(yàn)證時(shí)應(yīng)首先確定分析中可能出現(xiàn)問(wèn)題的變量(如:孵育時(shí)間、試劑純度及試劑濃度等),并隨后在國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(international conference on harmonisation,ICH)文件ICH-Q2A和ICH-Q2B的指導(dǎo)下對(duì)整個(gè)操作規(guī)程進(jìn)行驗(yàn)證。針對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operation procedure,SOP)的驗(yàn)證過(guò)程應(yīng)該包括:準(zhǔn)確性、精確性、特異性、檢出限界、定量限界、線(xiàn)性及檢測(cè)范圍。

5 ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用展望

ELISPOT技術(shù)目前得到了廣泛的應(yīng)用,其涉及范圍包括:A IDS、癌癥、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病以及移植方面的研究;感染性疾病的免疫監(jiān)測(cè);疫苗的研發(fā)與檢測(cè);免疫顯性表位的鑒定等[20-25]。ELISPOT技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究方面所受的限制不在于技術(shù)本身,而在于人們的想象力與創(chuàng)新思維,客觀(guān)地說(shuō),在一切免疫學(xué)研究的前沿領(lǐng)域,ELISPOT技術(shù)都是最有力的研究工具之一。

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