基于高通量測序和Q-PCR芯片技術(shù)分析養(yǎng)殖環(huán)境中蒼蠅攜帶細菌菌群結(jié)構(gòu)和耐藥基因特點

張紅娜，周玉法，崔 娜，翟真真

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，石家莊 050061；2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局，山東 泰安 271000；3.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000）

蒼蠅在人類和動物活動環(huán)境中十分常見，如餐廳、醫(yī)院、農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場及養(yǎng)殖場等[1]。蒼蠅腳和口器帶有腺毛和墊子，分泌大量黏性物質(zhì)，易攜帶大量微生物包括葡萄球菌、腸球菌、志賀氏菌、大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌、衣原體、棒狀桿菌等；蒼蠅腸道也是耐藥基因和毒力基因在細菌間水平轉(zhuǎn)移適宜場所[2-3]。因此，蒼蠅可通過食物鏈將攜帶的大量病原菌和多重耐藥菌傳遞給人和動物，威脅公共健康安全[4]。蒼蠅攜帶病原菌與其所處環(huán)境密切相關(guān)，如動物養(yǎng)殖場長期使用抗生素，蒼蠅攜帶大量耐藥菌株[5]。

動物養(yǎng)殖場中糞便、尿液、腐蝕物等為蒼蠅生長發(fā)育提供豐富營養(yǎng)，也為動物源耐藥菌散播提供媒介[6-7]。Marc等和de Jong等研究報道，動物養(yǎng)殖場蒼蠅和糞便中均檢測到耐臨床一線抗生素細菌，如第三代頭孢菌素和氟喹諾酮[8-9]。由于抗生素大量使用甚至濫用，動物養(yǎng)殖場已成為耐藥基因存儲庫[10]，因此深入研究動物養(yǎng)殖環(huán)境中蒼蠅攜帶細菌耐藥情況，有助于了解養(yǎng)殖場耐藥菌特點，對防控耐藥基因散播具有重要意義。

目前，定量聚合酶鏈反應（Quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）芯片技術(shù)可同時檢測大量ARG，且具有樣品用量少、操作方便和反應快速等優(yōu)點，廣泛應用于環(huán)境耐藥性檢測[11]。因此，本研究采用高通量測序和Q-PCR芯片技術(shù)，以雞舍和奶牛舍為采樣地點，系統(tǒng)分析蒼蠅和糞便樣品中細菌菌群結(jié)構(gòu)、潛在致病菌、耐藥基因（Antibiotic resistance gene，ARG）和移動遺傳元件（Mobile gene elements，MGE），為養(yǎng)殖場衛(wèi)生管理、蒼蠅治理及耐藥性散播防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年9月選擇山東省泰安市一個全封閉雞舍和一個半開放奶牛舍作為采樣點，兩個采樣點之間距離大于5.0 km。每個養(yǎng)殖舍內(nèi)放置一條無毒、無殺蟲劑和無氣味捕蠅網(wǎng)，2 h后回收。用無菌鑷子將蒼蠅從網(wǎng)中取出，分別放入含有800 μL磷酸鹽緩沖液無菌1.5 mL離心管，置于冰塊上1 h內(nèi)送回實驗室。利用無菌組織勻漿器將蒼蠅均質(zhì)化，5 000 r·min-1離心20 s，保存于-80℃待用。從雞舍（n=15）和奶牛舍（n=15）中共捕獲30只蒼蠅。

同時，在靠近捕蠅網(wǎng)位置用無菌棉拭子采集新鮮糞便樣品，置于無菌離心管，保存于-80℃待用。從雞舍（n=6）和奶牛舍（n=6）中共采集12份糞便樣品。

1.2 細菌菌群分析

根據(jù)說明書，使用MO BIO PowerSoil DNA試劑盒(Qiagen公司)提取蒼蠅勻漿和糞便樣品DNA。PCR擴增16S rRNA基因V4高變區(qū)，引物為515F（5'GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3'）和 806R（5'GG ACTACHVGGGTWTCTAAT 3'），PCR條件參考文獻[12]。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，并純化回收。根據(jù)Illumina TruSeq DNA文庫制備方法構(gòu)建DNA文庫，并在Illumina MiSeq平臺（上海美優(yōu)生物公司）上作雙末端測序。

采用QIIME（v1.9.1）處理序列數(shù)據(jù)，序列拼接后去掉＜150 bp且模糊片段以及無法矯正的條形碼。根據(jù)97%同源性歸類操作分類單元（Operational taxonomic units,OTUs），使用Usearch去掉嵌合體。利用NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）和核糖體數(shù)據(jù)庫工程（Ribosomal Database Project）（http://rdp.cme.msu.edu）中BLASTn對OTUs分類。根據(jù)目前已知致病菌[13]，在屬水平鑒定樣品中致病菌。

1.3 Q-PCR芯片檢測

采用WaferGen SmartChip Real-time PCR系統(tǒng)（WaferGen Bio-systems公司）作Q-PCR，設(shè)置循環(huán)閾值（Ct）為30。首先對糞便樣品DNA作初步QPCR芯片檢測，在384引物組中檢測到372個靶向ARG/MGE，可歸類為12種耐藥基因型：氨基糖苷類（n=61），酰胺醇類（n=20），β-內(nèi)酰胺類（n=55），氟喹諾酮類（n=12），MGE（n=48），多重耐藥類（Multidrug resistance，MDR；常指多種藥物外排泵基因，n=43），大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺-鏈霉菌素 B（Macrolides-lincosamide-streptogramines B，MLSB；n=43），磺胺類（n=6），四環(huán)素類（n=27），甲氧芐氨嘧啶類（n=17），萬古霉素類（n=24）和其他質(zhì)粒介導耐藥基因（n=13）[14]。使用Qubit 3.0熒光計檢驗DNA濃度和質(zhì)量，將每個樣品DNA稀釋至相同濃度和質(zhì)量。微流控SmartChip具有5 184個反應孔（每孔100 nL反應體系），制備372個靶向基因Q-PCR陳列后，使用多樣品納米分配器（TaKaRa）將PCR混合物分配到芯片反應孔，QPCR反應：95℃初始酶活化10 min，40個循環(huán)包括95℃變性30 s，60℃退火30 s。每個Q-PCR反應重復3次。

1.4 統(tǒng)計分析

通過比較不同組OTUs和Shannon指數(shù)分析Alpha多樣性，使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗比較各組之間Alpha多樣性是否具有差異性。利用QIIME中SourceTracker量化蒼蠅攜帶細菌菌群來源。將映射到指定OTUs序列數(shù)除以每個樣品序列總數(shù)計算細菌菌群相對豐度。通過計算單個OTU相對豐度＞0.001%樣本數(shù)量分析致病菌流行率。利用卡方檢驗比較蒼蠅和糞便之間ARG和MGE特點。利用Pearson correlation分析ARG和MGE與細菌菌群之間相關(guān)性，r＞0.9時顯著正相關(guān)。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌菌群結(jié)構(gòu)

分析不同動物養(yǎng)殖舍內(nèi)蒼蠅和糞便中細菌菌群在門水平組成結(jié)構(gòu)（見圖1）?？傮w上，在蒼蠅和糞便中共檢測到13個細菌門。在蒼蠅中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）為絕對優(yōu)勢菌群，均占雞舍蒼蠅和奶牛舍蒼蠅總細菌菌群99%以上。在糞便中，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋體門（Spirochaetae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和互養(yǎng)菌門（Synergistetes）為絕對優(yōu)勢菌群，約占雞糞便和奶牛糞便總細菌菌群98%。雞舍蒼蠅中未發(fā)現(xiàn)螺旋體門，雞糞便中未發(fā)現(xiàn)綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）；而奶牛舍中，蒼蠅和糞便中均檢測到這13個細菌門。結(jié)果表明糞便樣品中鑒定的細菌門出現(xiàn)在蒼蠅體內(nèi)。

從圖1可以看出，同一養(yǎng)殖場內(nèi)蒼蠅之間、蒼蠅與糞便之間優(yōu)勢細菌門組成結(jié)構(gòu)相似；而不同養(yǎng)殖場蒼蠅之間、糞便之間細菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大。例如，雞舍內(nèi)厚壁菌門在蒼蠅和糞便中分別占61.04%、67.81%；奶牛舍內(nèi)厚壁菌門在蒼蠅和糞便中分別占37.41%、37.42%。同樣，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門等也顯示相同趨勢。說明蒼蠅細菌菌群結(jié)構(gòu)受同一養(yǎng)殖場內(nèi)動物糞便影響。Park等研究表明，蒼蠅攜帶細菌群落組成因棲息地不同而變化，且與所處環(huán)境微生物組成密切相關(guān)，尤其腐爛和排泄物豐富環(huán)境[15]。

2.2 細菌菌群α多樣性分析

基于16S rRNA和α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，蒼蠅細菌菌群OTUs數(shù)量和多樣性受相應養(yǎng)殖舍動物糞便影響（見圖2）?；?6S rRNA分析（見圖2a），蒼蠅中鑒定447～665個OTUs，奶牛舍蒼蠅中平均OTUs（574.33±67.42）高于雞舍蒼蠅中 OTUs（508.50±53.47）；糞便樣本中鑒定出902～2 170個OTUs，奶牛糞便中平均OTUs（1 506.67±355.65）顯著高于雞糞便中OTUs（1 040.33±128.14）。

經(jīng)α多樣性分析（見圖2b），奶牛舍蒼蠅細菌菌群Shannon指數(shù)（4.36±1.12）顯著高于雞舍蒼蠅（3.13±1.51）；奶牛糞便細菌菌群Shannon指數(shù)（7.53±0.70）最高，顯著高于雞糞便（5.32±1.36）。以上結(jié)果顯示，奶牛舍蒼蠅攜帶細菌菌群組成結(jié)構(gòu)比雞舍蒼蠅更復雜，表明蒼蠅細菌菌群多樣性受所處環(huán)境動物糞便影響。

2.3 蒼蠅細菌菌群溯源

SourceTracker追蹤分析（見圖3a）顯示同一養(yǎng)殖舍內(nèi)動物糞便是蒼蠅中細菌菌群主要貢獻因素。雞舍蒼蠅細菌菌群主要由雞糞便提供（68.5%）。相比之下，奶牛舍蒼蠅攜帶細菌群落大部分來源未知（51.8%），這可能與奶牛舍環(huán)境相對開放有關(guān)，但奶牛糞便仍是影響奶牛舍蒼蠅細菌群落主要因素（39.7%）。Bray-curtis距離分析（見圖3b）顯示蒼蠅攜帶細菌菌群與所處環(huán)境動物糞便細菌菌群結(jié)構(gòu)更接近，進一步驗證上述結(jié)果。

2.4 潛在致病菌

在屬水平共鑒定出1 025個細菌屬。蒼蠅中鑒定出953個細菌屬，其中32個細菌屬被認為是人類和/或動物致病菌屬（見表1）。在糞便樣本中鑒定出561個細菌屬，其中21個細菌屬被認為是致病菌屬（見表2）?？梢钥闯?，在較低分類水平蒼蠅中顯示出較高多樣性。值得注意，9個致病菌屬在蒼蠅和糞便中均具有較高的豐度（＞0.1%），包括不動桿菌屬（Acinetobacter），假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、彎曲菌屬（Campylobacter）、博代氏桿菌屬（Bordetella）、腸球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、污蠅桿菌屬（Wohlfahrtiimonas）。

圖1 門水平蒼蠅和動物糞便中細菌菌群組成Fig.1 Bacterial composition of flies and feces at phylum level

圖2 蒼蠅和糞便中細菌菌群多樣性分析Fig.2 Diversity analysis of bacterial communities of flies and feces

圖3 養(yǎng)殖舍蒼蠅細菌菌群溯源分析Fig.3 Source tracking of bacterial community of flies trapped from breeding environment

表1 屬水平蒼蠅樣本中潛在致病菌Table 1 Potential pathogens at genus level in flies samples (%)

表2 屬水平糞便樣本中潛在致病菌Table 2 Potential pathogens at genus level in feces samples (%)

續(xù)表

在雞舍蒼蠅中假單胞菌屬最多（19.74%），其次是氣單胞菌屬（Aeromonas，12.67%）；奶牛舍蒼蠅中，不動桿菌屬豐度最高（3.81%），其次是腸桿菌屬（Enterobacter，2.88%）、腸球菌屬（1.65%）等。兩個養(yǎng)殖舍糞便樣本中不動桿菌屬數(shù)量最多，其次假單胞菌屬。由表1和2可知，一些潛在致病菌在兩個采樣點蒼蠅中普遍存在且豐度較高，而某幾種潛在致病菌僅在其中一個采樣點存在。研究表明，周圍環(huán)境對蒼蠅攜帶潛在致病菌也具有影響[15-16]。

養(yǎng)殖場動物糞便為蒼蠅繁殖提供物質(zhì)條件，而蒼蠅與污染物接觸后，又通過其體表、口器攜帶并傳播具有感染性致病菌，如致病性大腸桿菌，血清型沙門氏菌等，對人類和動物健康產(chǎn)生威脅[17-18]。此外，蒼蠅也可能是耐藥性致病菌在動物和人類之間傳播媒介或關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19-20]。

2.5 ARG和MGE特點

經(jīng)Q-PCR陣列在兩個采樣點糞便和蒼蠅中共檢測到256個ARG和44個MGE，鑒定出12種耐藥基因型均（見表3）?？傮w上，糞便中檢測到234個ARG和39個MGE，高于在蒼蠅中210個ARG和32個MGE，且蒼蠅中耐藥基因均可映射到糞便中。奶牛舍蒼蠅（203）和糞便（253）中檢測到ARG/MGE數(shù)量均高于雞舍蒼蠅（198）和糞便（241）。

表3 蒼蠅和糞便中ARG和MGE鑒定Table 3 Identified ARG and MGE in flies and feces

圖4顯示各組樣品ARG和MGE特點。在雞舍內(nèi)，蒼蠅和糞便中最常見ARG主要是氨基糖苷類、多重耐藥（Multidrug resistance，MDR）、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因；在奶牛舍內(nèi)，蒼蠅和糞便最常見ARG主要是氨基糖苷類、甲氧芐氨嘧啶類、MDR。此外，雞舍內(nèi)，蒼蠅和糞便中MGE分別占16.95%和18.36%；奶牛舍內(nèi)，蒼蠅和糞便中MGE分別占14.60%和12.50%?？梢钥闯觯n蠅與同一采樣點內(nèi)動物糞便ARG和MGE特點一致。

圖4 蒼蠅和糞便中ARG和MGE組成分布Fig.4 Distribution of ARG and MGE in flies and feces

利用Pearson correlation分析主要ARG和MGE類型與其攜帶菌（屬水平）相關(guān)性（見表4和5）。本研究中主要ARG類型為氨基糖苷類、胺酰醇、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、MDR、MLS、磺胺類、四環(huán)素類、甲氧芐氨嘧啶類和萬古霉素類等；主要 MGE 類型為 Tp614、IS613、tnpA、intI1_337、IncN_oriT、 orf37-IS26、 ISEfm1-Entero、 int1-amarko、intl2和intl3等。表5和6同時顯示，主要ARG和MGE與其攜帶菌具有顯著正相關(guān)（r＞0.9）。由于蒼蠅可長距離飛行，這些ARG可通過蒼蠅攜帶造成大面積散播，另外，MGE進一步加劇耐藥基因在細菌間轉(zhuǎn)移，間接表明動物源耐藥菌攜帶多種耐藥基因的原因。

2.6 共有ARG和MGE

蒼蠅與糞便之間存在215個共有ARG和MGE，分別占蒼蠅總ARG和MGE 88.84%（215/242）和糞便總ARG和MGE 78.75%（215/273）。通過使用卡方檢驗比較蒼蠅與不同動物糞便之間共享ARG和MGE數(shù)量百分比（見圖5）發(fā)現(xiàn)，雞舍蒼蠅—雞糞便共有ARG和MGE數(shù)量百分比（56.02%，135/241）高于奶牛舍蒼蠅—雞糞便（43.57%，105/241），且差異極顯著；奶牛舍蒼蠅—奶牛糞便共有ARG和MGE數(shù)量百分比（54.94%，139/253）同樣顯著高于雞舍蒼蠅—奶牛糞便（44.27%，112/253）。

與細菌菌群分析結(jié)果一致，不同動物舍蒼蠅攜帶ARG和MGE特點與其所處環(huán)境動物糞便相近，由于檢測到的ARG和MGE主要存在于4個細菌門中，即變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門[21]。本研究中4個可能富含ARG和MGE的細菌門均占兩個采樣點蒼蠅細菌菌群99.0%以上。說明在養(yǎng)殖場內(nèi)蒼蠅和糞便均是耐藥基因載體，同時也說明蒼蠅可作為某一環(huán)境中耐藥基因特點參照物。

表4 ARG與屬水平細菌菌群之間Pearson相關(guān)分析（r＞0.9）Table 4 Pearson correlation between ARG and bacteria at genus level

值得注意的是，奶牛舍蒼蠅中8.5%細菌菌群顯示來自雞舍糞便，且同一采樣點內(nèi)蒼蠅細菌菌群以及ARG和MGE特點也存在一定多樣性，可能由于蒼蠅遷徙過程中可能在糞便、廢水和腐爛有機物上吸食和產(chǎn)卵，接觸細菌和耐藥基因[22]。

蒼蠅在畜禽養(yǎng)殖場接觸動物排泄物，隨后很可能將獲得細菌和耐藥基因帶到不同環(huán)境中，包括人類生活區(qū)[1-2]。因此，為進一步了解蒼蠅在監(jiān)測耐藥性動態(tài)指示作用，有必要開展大規(guī)模、長時間和不同地理空間研究。同時，由于耐藥基因在蒼蠅和糞便中高流行率，應建立蒼蠅評估耐藥性公共衛(wèi)生框架。

表5 MGE與屬水平細菌菌群之間Pearson相關(guān)分析（r＞0.9）Table 5 Pearson correlation between MGEs and bacteria at genus level

圖5 蒼蠅和不同動物糞便共有ARG和MGEFig.5 SharedARGandMGEbetweenfliesandanimalfeces

3 結(jié) 論

本研究中養(yǎng)殖舍蒼蠅攜帶細菌菌群結(jié)構(gòu)以及ARG和MGE組成分布與同域動物糞便相近，表明動物糞便是養(yǎng)殖舍蒼蠅攜帶細菌菌群和耐藥基因主要貢獻因素。因此，養(yǎng)殖場蒼蠅不僅是耐藥基因和病原菌傳播媒介，也是反映其所處環(huán)境耐藥基因污染程度重要指標。