動物組織線粒體DNA研究進展

樊賀明 楊明妍 畢峰

線粒體基因組也叫線粒體DNA(mtDNA，Mitochondrial DNA)，結(jié)構(gòu)與細菌DNA相似，呈雙鏈環(huán)狀，可獨立編碼一些蛋白質(zhì)，是核外遺傳物質(zhì)，人們在線粒體中已發(fā)現(xiàn)RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖體等全套裝備，說明線粒體具有獨立的遺傳體系。

1 mtDNA的構(gòu)成

mtDNA分子為環(huán)狀雙鏈DNA分子，外環(huán)為重鏈（H），內(nèi)環(huán)為輕鏈（L）。基因排列非常緊湊，除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無內(nèi)含子序列。每個線粒體含數(shù)個mtDNA，動物組織mtDNA約16～20kb，大多數(shù)基因由H鏈轉(zhuǎn)錄，包括2個rRNA，14個tRNA和12個編碼多肽的mRNA，L鏈編碼另外8個tRNA和一條多肽鏈。mtDNA上的基因相互連接或僅間隔幾個核苷酸序列，一些多肽基因相互重疊，幾乎所有閱讀框都缺少非翻譯區(qū)域。很多基因沒有完整的終止密碼，而僅以T或TA結(jié)尾，mRNA的終止信號是在轉(zhuǎn)錄后加工時加上去的。

2 mtDNA的組成特點

mtDNA是一共價閉合的雙鏈環(huán)狀遺傳物質(zhì),具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點。其分子大小在14～42kb之間，絕大多數(shù)介于16～18kb,mtDNA已被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機理、臨床診斷、遺傳變異、生物進化等多方面的研究，并已在分類學(xué)、種系鑒定、遺傳學(xué)、進化論等領(lǐng)域取得一定的成就[1]。對大量不同動物(包括人在內(nèi)的13種哺乳動物、2種鳥類、2種兩棲類、6種魚類、4種爬行類、6種昆蟲類等) 線粒體基因組全序列測定表明, 動物線粒體基因由大致為15～20kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子組成。雙鏈3′端是一段具有二級結(jié)構(gòu)的高保守性控制區(qū),控制線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這一區(qū)域多是串聯(lián)重復(fù)序列，并在核DNA上有同源區(qū)。它與轉(zhuǎn)座、錯配表達和線粒體基因異質(zhì)(heteroplasmy)相關(guān)[2-3]。

3 mtDNA的結(jié)構(gòu)特點

mtDNA結(jié)構(gòu)基因排列緊湊,幾乎沒有間隙序列和內(nèi)含子。在編碼脯氨酸和苯丙氨酸t(yī)RNA的基因之間,由少數(shù)堿基構(gòu)成一個突出結(jié)構(gòu)—D環(huán),它由與輕鏈互補的一小段DNA合成,并在這一區(qū)域取代了重鏈。D環(huán)是mtDNA與細胞核相聯(lián)絡(luò)的重要區(qū)域,也是mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。該區(qū)在人、鼠、豬的mtDNA中是相當保守的,可形成一種發(fā)夾樣次級結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)可與線粒體引發(fā)酶、γ-DNA-多聚酶和線粒體拓外異物酶Ⅰ和Ⅱ等強烈結(jié)合[4]。

4 mtDNA 的制備方法

mtDNA制備方法是國內(nèi)外研究的熱點，目前已有較多報道，可分為：超速離心法、差速離心法、堿裂解法和柱層析法。現(xiàn)將國內(nèi)外幾種較好的提取組織線粒體DNA的方法進行比較[5]。

4.1 非離子型去污劑法

戴紀剛等利用非離子型去污劑TrionX-100能溶解除核膜以外的所有細胞膜的特點，建立了一種通過核質(zhì)分離技術(shù)制備mtDNA的方法。通過適當?shù)碾x心，分離細胞核/細胞質(zhì)來獲取mtDNA。其主要優(yōu)點是不需要分離細胞的總DNA，也不需要分離和純化細胞線粒體，而是從完整細胞直接分離mtDNA，方法簡單快速，對實驗設(shè)備和試劑要求不高，一般實驗室均可應(yīng)用。由此可見，本方法制備mtDNA完全可以滿足常規(guī)的研究工作的需要。

4.2 差速離心法

朱克軍等[6]以差速離心法分離線粒體,用堿性SDS法裂解線粒體膜,釋放線粒體DNA后用酚/氯仿抽提,TE或ddH2O溶解，然后將所得線粒體DNA進行純度鑒定，并和其他方法制備的線粒體DNA經(jīng)PCR進行擴增,比較擴增效果。

4.3 密度梯度離心法

密度梯度離心法純化DNA是一種廣泛應(yīng)用的方法，其突出優(yōu)點是獲得的DNA純度高。但經(jīng)典的等密度梯度離心法的離心時間需要48～60h，實驗周期長，儀器損耗大，對于電壓不穩(wěn)的實驗室，這個問題還直接危及儀器的安全，而且，DNA樣品長時間暴露在高濃度的鹽(如CoCI)溶液中，容易受損傷。徐秀英等[7]采用兩級梯度離心法純化DNA，離心時間只需5h，離心效果與48h經(jīng)典的密度梯度離心法無明顯差別，達到了快速純化的目的。

4.4 堿裂解法

堿裂解法，即SDS堿裂解法。其主要原理是通過使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，相互纏繞成大型復(fù)合物，被十二烷基磺酸鈉包蓋，當用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效沉淀下來，離心后即可從上清中回收質(zhì)粒DNA。(1)Tamura等[8]通過改進提取質(zhì)粒DNA的堿裂解法來提取線粒體DNA,優(yōu)點是簡便快捷，缺點是微量制備，如果要檢測大量個體，堿裂解法就會顯得非常麻煩和費時。(2)劉麗紅等[9]提出了一種直接以組織細胞制備mtDNA的技術(shù)方法，其優(yōu)點:①對實驗設(shè)備和試劑要求不高,一般實驗室均可應(yīng)用。②該方法對標本要求不高，-70℃冰凍保存或液氮保存即可。③mtDNA產(chǎn)率有極大提高,mtDNA樣品紫外分光光度檢測結(jié)果表明,每克組織可獲得約8μg mtDNA。④不需要分離細胞的總DNA，也不需要分離和純化細胞線粒體,而是從完整細胞直接分離mtDNA。因此,本方法簡便快速,僅需2～3h,重復(fù)性好。⑤本方法尤其適用于標本量少,經(jīng)費不足時mtDNA模板的制備。⑥用本方法所得mtDNA樣品純度高。

4.5 柱層析法

層析分離技術(shù)是一種物理的分離方法、它利用混合物中的各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等），各組分以不同程度分布在兩相中，從而使各組分以不同速度移動而達到分離。柱層析法是利用各分子形狀和大小不同，在層析柱中的流速不同而將各組分分離。此方法操作簡單，效果好，重復(fù)性高，應(yīng)用廣泛。常用于線粒體分離[10]。

人類及絕大多數(shù)哺乳動物細胞mtDNA都是閉環(huán)雙鏈DNA分子。動物組織線粒體DNA的提取方法依其動物本身組織的不同特點，從方法學(xué)研究角度看,對新鮮動物線粒體DNA提取分離方法常用的有酚氯仿萃取、乙醇沉淀、CsC1超速離心、酸性緩沖液、堿性緩沖液等[11]。而對中藥材來說,DNA一般因加工、干燥、儲藏等過程部分降解同時易受到細胞中抑制PCR的蛋白質(zhì)、多糖類、多酚類成分的影響,在提取DNA時加入SDS等蛋白質(zhì)變性劑,在PCR時加入小牛血清蛋白(BSA)以滅活內(nèi)源性核糖酶,排除干擾PCR的色素物質(zhì)[12-13]。

分子遺傳學(xué)標記技術(shù)為中藥材與易混品種的鑒別提供了一條新的途徑[14]。線粒體DNA（mtDNA）作為遺傳信息的載體，是研究動物起源進化及對群體進行遺傳分析的理想對象，線粒體細胞色素b[15-16]（cytb）基因進化速度適中，是分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和進化關(guān)系的適當DNA片段，可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究[17]。

5 應(yīng)用前景

我國雖有豐富的中草藥資源，但由于缺乏系統(tǒng)的整理和歸類，致使中藥材同名異物、同物異名的現(xiàn)象屢有發(fā)生；中藥商品市場混亂，多有以假充真、以次充好的情況；隨著人們“回歸自然”迫切需求，中藥需求量的日益擴大，資源矛盾日趨尖銳。而解決這些問題的關(guān)鍵是要有一套簡便快速、準確有效的鑒別中藥材正品的技術(shù)與方法，以杜絕假、劣及混淆品的干擾；找出形成質(zhì)量優(yōu)、產(chǎn)量高的道地藥材的機制，明確其生長條件，以培育出更多優(yōu)質(zhì)的重要原材料；對于珍稀、瀕危動植物，則需要大力保護，積極尋找替代品，或根據(jù)習(xí)性進行人工栽培和繁殖[18]。

目前，分子生物學(xué)技術(shù)已成為中藥DNA指紋圖譜鑒定的一項主要技術(shù)，DNA分子標記技術(shù)在中藥鑒定和質(zhì)量檢測方面均有其獨到的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，但仍需完善[19]。而動物mtDNA的研究已廣泛滲透到保護生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)等學(xué)科中。早期的mtDNA的研究主要集中于限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP），近年來，隨著DNA測序技術(shù)的成熟和普及，mtDNA的研究不斷深入，應(yīng)用日趨廣泛[20]。

總之，DNA指紋圖譜技術(shù)具有快速、微量、特異性強等特點，且不受生長發(fā)育階段、供應(yīng)部位、環(huán)境條件的影響，已在中藥鑒定學(xué)研究中展示了良好的應(yīng)用前景，并保持了強勁的發(fā)展勢頭[21]。

[1] 戴紀剛,吳宇,魏泓,等.一種簡單快速制備動物線粒體DNA的方法[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,22(4):391-392.

[2] Kuma zawa Y,OtaH, et al.The complete nucleotide sequence of asnake (Dinodon semicarinat us) mitochondrial genome with two identical control regions. Genetics,1998,150(1):313-329.

[3] 廖順堯,魯成.動物線粒體基因組研究進展[J].生物化學(xué)與生物物理進展,2000,27(5):508-512.

[4] 茍德明,王智新.動物線粒體DNA特性及其多態(tài)性研究進展[J].遺傳育種,1996,22(4):7-10.

[5] 閆華超,賈少波,許恒龍,等.動物線粒體DNA提取簡易流程及其優(yōu)化[J].生物技術(shù)通訊,2007,18(1):95-97.

[6] 朱克軍,汪振誠,王學(xué)敏,等.一種改進的提取人外周血和組織線粒體DNA的方法[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004,25(04):444-446.

[7] 徐秀英,黃翠芬.快速密度梯度離心法純化質(zhì)粒DNA[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊1986,10(6):481-484.

[8] Tumura K, T Aotsuka. Rapid Isolation Method of Animal mitoc-hondrial DNA by the Alkaline lysis procedure[J].Biochem Genct,1988,26(11-12):815-819.

[9] 劉麗紅,胡義,賈立明.簡便快速提取人肺癌組織線粒體DNA[J].中國肺癌雜志中國肺癌雜志,2005,6(8):186-189.

[10] 夏玉玲,劉彥群,魯成.動物線粒體DNA提取的原理和方法[J].蠶學(xué)通訊,2002,9(22):24-29.

[11] TaylorBH, Manhart J Rand Amasino RM.Isolation and Characteriazation of DNAs.In: Glick BR and Thompson JE (Eds.).Methods in Plantolecular Biologyand Biotechnology [J].BocaRaton:CRC Press,1993:37.

[12] Fushimi H, Komatsu K, Isobe M, et al.18S Ribosomal RNA Gene Sequences of Three Panax Species and the Corresponding GinsengDrugs[J].BiolPharmBull1996;19:1350.

[13] 曹暉,劉玉萍.DNA分析技術(shù)在中藥質(zhì)量研究中的應(yīng)用[J].中藥新藥與臨床藥理,1997,6(8):112-115.

[14] 王義權(quán),徐珞珊,徐國鈞,等.DNA分子遺傳標記鑒別在生藥鑒定中的應(yīng)用前景[J].中國中藥雜志,1997,22(10):583-586.

[15] 李偉，張雁云.基于線粒體細胞色素b基因序列探討紅喉姬兩亞種的分類地位[J].動物學(xué)研究,2004,4,25(2):127-131.

[16] 崔雨新,王小明,梁云媚.在線粒體DNA細胞色素b基因序列水平上對鬣羚系統(tǒng)發(fā)育的研究[J].獸類學(xué)報，2001,21(4):251-258.

[17] Kocher W.K,Thomas A, Meyer S.V,etal. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals:Amplificaton and sequencingwithconserved primers.Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989,86:6196-6200.

[18] 邵鵬柱,曹暉.中藥分子鑒定[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,2004：21.

[19] 高精度血液循環(huán)DNA定量檢測研究[J].當代醫(yī)學(xué),2010(06):68-69.

[20] 李太平,李均祥,鄧昭華.動物線粒體DNA的研究進展[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2003,33(4):32-34.