細胞凋亡的主要檢測方法研究進展

張廣智,胡長敏,陳穎鈺,劉 穎,李 帥,羅 雨,王金勇,郭愛珍*,3,陳煥春

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,湖北武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室,湖北武漢 430070;3.國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室,湖北武漢 430070)

細胞凋亡的主要檢測方法研究進展

張廣智1,2,胡長敏1,3,陳穎鈺1,2,劉 穎1,2,李 帥1,2,羅 雨1,2,王金勇1,2,郭愛珍*1,2,3,陳煥春1,2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,湖北武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室,湖北武漢 430070;3.國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室,湖北武漢 430070)

細胞凋亡是生理性細胞死亡過程,凋亡在維持動物機體內(nèi)環(huán)境平衡中扮演著極其重要的角色。細胞凋亡的準確檢測是研究細胞凋亡相關(guān)機制,以及評價細胞凋亡在相應組織或疾病中影響的第一步。形態(tài)學是檢測細胞凋亡的最直觀的方法,至今一直作為細胞凋亡檢測的金標準。DNA片段化檢測主要有DNA ladder,T UNEL檢測法和ELISA檢測法。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡的早期事件。凋亡相關(guān)基因的檢測包括促凋亡基因的檢測和抑制凋亡基因的檢測。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡是近些年發(fā)展的簡單快捷的方法,即可定性又可定量。Ca2+作為細胞內(nèi)重要的信號分子其濃度和細胞凋亡關(guān)系密切相關(guān)。

細胞凋亡;線粒體膜電位;流式細胞術(shù)

*通訊作者

細胞凋亡是由基因調(diào)控的細胞主動性死亡過程。細胞凋亡的特征是具有明顯的形態(tài)學改變,包括細胞膜發(fā)泡,細胞皺縮,線粒體膜電位下降,染色體凝聚和DNA片段化等[1]。近年研究表明,細胞凋亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。研究表明,機體內(nèi)細胞凋亡是受多基因精細調(diào)控的結(jié)果[2],過量或者過少的細胞凋亡均對機體有害。人類及動物的多種疾病的發(fā)生發(fā)展均與細胞凋亡密切相關(guān),如果能恰當?shù)淖钄嗷蚣铀偌毎蛲?可以為治療或防控凋亡相關(guān)疾病提供新的治療途徑[3]。細胞凋亡的檢測是開展凋亡研究的必需步驟,凋亡的所有檢測方法是基于凋亡細胞所特有的形態(tài)學和生物化學特征建立的。

1 細胞凋亡的形態(tài)學檢測

細胞發(fā)生凋亡時具有固有的形態(tài)特征,如細胞核表現(xiàn)縮小、染色質(zhì)邊緣化、凝集,凋亡晚期還會出現(xiàn)由核碎片與胞質(zhì)內(nèi)的部分細胞器混合在一起,且被細胞膜包裹形成的凋亡小體[4]。DNA特異性染料(如 Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區(qū)進行非嵌入式結(jié)合,從而使細胞核著色,在紫外光激發(fā)時會出現(xiàn)明顯的熒光[5]。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞染色質(zhì)的形態(tài)學變化、膜結(jié)構(gòu)及通透性的改變,從而鑒別凋亡細胞、正常細胞及壞死細胞。細胞凋亡的形態(tài)學檢測結(jié)果直觀,至今仍是判定細胞是否發(fā)生凋亡的金標準,但觀察凋亡細胞的形態(tài)特征耗時費力,不適于大量凋亡樣本的檢測[6]。

2 細胞凋亡的DNA片段化檢測

2.1 DNA ladder

提取凋亡細胞的基因組DNA,經(jīng)電泳后染色觀察可見180 bp～200 bp及其不同倍數(shù)的彌散狀DNA條帶,即DNA ladder。DNA ladder被視為經(jīng)典的檢測細胞凋亡的指標,但DNA凝膠電泳特異性雖高而靈敏度偏低,不適于檢測細胞凋亡初期DNA鏈的輕微損傷。

2.2 T UNEL檢測法

T UNEL法是一種將分子生物學和免疫組織化學相結(jié)合的原位檢測凋亡細胞DNA片段的方法。其基本原理為:細胞發(fā)生凋亡時核酸內(nèi)切酶被激活,染色質(zhì)或DNA被核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生180 bp～200 bp的含3′-OH末端的片斷,脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶將結(jié)合有熒光素的核苷酸(dUTP)標記到缺口3′-OH的末端,依次加入 HRP抗熒光素抗體和HRP顯色底物DAB,凋亡細胞顯色明顯,而正常細胞沒有DNA斷裂或者只有少量的DNA發(fā)生斷裂,故不被顯色[7]。T UNEL法因其靈敏高而被廣泛用于各種凋亡細胞的檢測,由于在壞死細胞內(nèi)也可能存在DNA片段化,所以只有DNA鏈普遍斷裂才能證明細胞發(fā)生凋亡。另外,在TUNEL法具體試驗操作過程中,需要摸索細胞的固定及消化時間,以提高該技術(shù)的敏感性和獲得較低的背景值[8]。

2.3 ELISA檢測法

應用ELISA方法也可以檢測DNA片段化,在凋亡的早期DNA發(fā)生斷裂,核小體釋放進入細胞質(zhì)中,核小體是染色質(zhì)的基本單元,通過ELISA檢測凋亡細胞釋放到細胞質(zhì)中的核小體從而確定細胞凋亡程度[9]。此方法既可定性又可以定量,而且適合檢測大批量樣本,不需要特殊的儀器。試驗過程中如果裂解細胞的時間過長可能導致細胞核中的DNA片段也被計算在內(nèi),進而導致結(jié)果偏高,因此不同的細胞系需要經(jīng)過數(shù)次摸索才能確定最佳檢測條件。

3 細胞凋亡的線粒體膜電位的檢測

細胞發(fā)生凋亡過程中,線粒體也會發(fā)生變化。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放導致的線粒體膜通透性發(fā)生變化,此被認為是線粒體導致細胞死亡的眾多途徑中關(guān)鍵的一個[10]。研究證實細胞在凋亡刺激信號的刺激下線粒體膜電位發(fā)生下降[11],線粒體膜電位的降低是細胞凋亡的早期事件,而且細胞聚集染料能力的下降可以用來反映膜電位的下降程度,進而通過流式細胞術(shù)檢測線粒體內(nèi)跨膜電位的變化。許多種染料可以用來檢測線粒體膜電位,染料的選擇取決于所用的激發(fā)光。常用的膜滲透性親脂性陽離子染料包括羅丹明123、JC-13、3′-二己基惡碳箐(3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide)和氯乙基紅(chloromethyl-X-rosamine)等[12]。除了用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位外,也可以通過熒光顯微鏡來觀察。由于該方法不能區(qū)分是否由于細胞凋亡導致的線粒體膜電位的變化,所以只能作為細胞凋亡檢測的補充方法。

4 細胞凋亡相關(guān)的基因檢測

4.1 凋亡促進基因表達的檢測

caspases家族基因表達產(chǎn)物是促進細胞發(fā)生凋亡的主要酶類,細胞凋亡機制的執(zhí)行基本都是由一個進化上保守的caspase完成的。在凋亡中根據(jù)其作用及扮演的角色不同,caspase可以分為2類,啟動caspase和執(zhí)行 caspase。啟動 caspase包括caspase 8、9、10,執(zhí)行 caspase 包括 caspase 3 、6、7。其中caspase 8和 10外源性細胞凋亡的啟動者,caspase 9是內(nèi)源性細胞凋亡的啟動者[13]。啟動caspase是經(jīng)過和其他凋亡相關(guān)分子結(jié)合后自激活的,執(zhí)行 caspase是被啟動 caspase激活后,執(zhí)行caspase經(jīng)過一系列的酶激活級聯(lián)反應,導致最后細胞凋亡[14]。不同的細胞系與不同的凋亡刺激因素會引起不同種類的caspases活化。因此,不同的細胞凋亡,也需要選取不同的caspase來檢測,最終確定凋亡促進基因的表達情況[15]。

4.2 凋亡抑制基因表達的檢測

通常在檢測細胞凋亡試驗中,除檢測凋亡促進基因的表達外,還會同時檢測抑制凋亡基因的表達情況來反映細胞凋亡,如核因子-κ B(NF-κ B),環(huán)氧合酶(COX)和 BCL-2家族成員等基因。NF-κ B是調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子,它參與了多種凋亡相關(guān)基因的表達,目前已發(fā)現(xiàn)NF-κ B可促使某些抗凋亡基因表達上調(diào)。COX定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近并普遍存在于多種組織細胞內(nèi),發(fā)揮其“看家”作用,促使生理性前列腺素的合成,以維護細胞自身穩(wěn)定和調(diào)節(jié)正常組織細胞的一些生理活動[16]。Bcl-xL和Bcl-2是BCL-2家族中的成員,它們在抗凋亡中均發(fā)揮了重要的作用,但在不同的細胞類型和不同的死亡信號作用過程中,兩者發(fā)揮的作用并不相同[17]。而且當細胞內(nèi)BCL-2抗凋亡成員的表達量增加時,線粒體通透性的改變和促凋亡蛋白的釋放所帶來的促凋亡作用可以被其抵消掉[18]。Beevi S S等[19]用RT-PCR檢測促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表達,進而確定了胡蘿卜提取物對人類癌細胞增殖和凋亡的影響。

5 細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測

5.1 細胞周期的測定

鑒于細胞凋亡后發(fā)生DNA斷裂,根據(jù)此特征應用 DNA結(jié)合染料,如碘化丙啶(Propidium iodide,PI)、吖啶橙(Acridineorange,AO),或 Hoechst dyes等進行細胞周期的檢測,判定細胞凋亡的程度和比率。由于DNA小片段溢出的程度受反應時間、溫度等影響,需要通過調(diào)整凋亡細胞的DNA含量,減少凋亡細胞與非凋亡細胞的重疊峰,進而增加試驗結(jié)果的可靠性[12]。Feng Qian等[20]用多種方法檢測京尼平引起的人白血病細胞系K562細胞凋亡,并用PI染色觀察細胞周期的分布。

5.2 Annexin V/PI雙染法測定

Annexin V/PI法是根據(jù)細胞凋亡早期細胞膜的磷脂對稱性發(fā)生改變,磷脂酰絲氨酸(PS)由細胞膜內(nèi)移位到細胞膜外,采用Annexin V/PI雙染,并通過流式細胞術(shù)測定細胞凋亡的方法。Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,Annexin V對PS具有高度的親和性,正常細胞表現(xiàn)為Annexin V-/PI-,壞死細胞表現(xiàn)為Annexin V+/PI+,凋亡細胞表現(xiàn)為Annexin V+/PI-,而機械性損傷細胞表現(xiàn)為Annexin V-/PI+[21]。武發(fā)菊等[22]通過對比發(fā)現(xiàn)吖啶橙和溴化乙錠雙重熒光染色法是定性測定細胞凋亡的較為可靠的方法,而FITC-Annexin V/PI雙染色流式細胞儀是較為理想的凋亡定量檢測方法。這兩種凋亡檢測方法的聯(lián)合應用比較適應于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中細胞凋亡的檢測。需要注意的是,在采用Annexin V/PI和Hoechst 33342/PI這兩種方法測定細胞凋亡都要保持細胞膜的完整性,因此在處理和細胞相關(guān)的步驟時要減少對細胞膜可能造成的損傷,比如要避免用乙醇和多聚甲醛的固定細胞,對于貼壁細胞,胰酶消化時間不宜過長等。。

6 細胞凋亡的Ca2+濃度變化的測定

Ca2+是細胞中一種十分重要的第二信使分子,細胞眾多的生命活動都有Ca2+的參與。關(guān)于Ca2+在細胞凋亡中的精確作用還存在很多的爭議,但目前的一致結(jié)論是:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+丟失會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力途徑的細胞凋亡發(fā)生,壓力誘發(fā)的Ca2+過多負載會導致更多的壞死,調(diào)節(jié)性Ca2+濃度的增加在內(nèi)源性細胞凋亡途徑中提供了重要的信號事件[23]。目前有多種方法可以用來測定胞漿內(nèi)Ca2+的變化,應用Ca2+特異性熒光探針,如 Rhod-2、Indo-1、Fura-2、Fura-3和Quin-2對細胞進行標記后,通過流式細胞術(shù)分析,不僅能檢測出細胞群體異質(zhì)性,并能對多項生化指標進行測定,故該法具有較高的優(yōu)越性。Jae Kyoo Lee[24]等通過Fluo-4熒光標探針檢測在特定壓力條件下細胞凋亡中Ca2+濃度的動態(tài)變化。

7 結(jié)語

細胞凋亡的檢測方法都是基于細胞凋亡過程中的各種特征設計的,在進行細胞凋亡檢測的時候,要綜合幾種方法進行檢測,因為目前沒有一種細胞凋亡的檢測方法是完美的,任何一種方法都是有局限性的。不同時間檢測細胞凋亡得到的結(jié)果也不一樣。因此,要想捕捉到明顯的細胞凋亡,就要設置不同條件進行檢測,比如刺激時間梯度和刺激源濃度梯度等。另外,針對不同時期的細胞凋亡情況的檢測,要選擇不同的檢測方法,比如要測定細胞早期凋亡,就要選擇Annexin V/PI法,線粒體膜電位的測定等;而形態(tài)學檢測,如 DNA ladder、TUNEL等檢測方法主要是針對細胞中晚期凋亡。因此,只有用幾種不同的檢測方法進行綜合檢測得到的結(jié)果,才能真正的反映細胞發(fā)生凋亡的情況,進而準確的對其凋亡進行定性和定量判定。相信伴隨著人類對凋亡機制的深入了解,操作簡單、敏感性高、成本低廉的細胞凋亡檢測方法會越來越多。

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Recent Advance on the Ways to Apoptosis Detection

ZHANG Guang-zhi1,2,HU Chang-min1,3,CHEN Ying-yu1,2,LIU Ying1,2,LI Shuai1,2,LUO Yu1,2,WANG Jin-yong1,2,GUO Ai-zhen*1,2,3,CHEN Huan-chun1,2

(1.College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Huber,430070,China;
2.The Stated K ey Laboratory of Agricultural Microbiology,Wuhan,Huber,430070,China;
3.National beef Cattle Industrial Technology Sy stem,Wuhan,Huber,430070,China)

Apoptosis is a programmed,physiological mode of cell death that plays an important role in maintaining the homeostasis of internal environment.The accurate detection of apoptosis is the first step to analysis the relative mechanisms of apoptosis and to assess the impact of apoptosis on the respective tissue and the disease.Morphologic is the most intuitionistic method to detect the cell apoptosis,and is still considered to be golden standard.DNA ladder,TUNEL,and ELISA are used to detect the DNA fragmentation.The decrease of mitochondria membrane potential is the early event of cell apoptosis.The detection of apoptosis-related genes include the proapoptosis genes and anti-apoptosis genes.Flow cytometry is a easy and fast method developed in recent years to detect the cell apoptosis,and it can be used for qualitative and quantitative analysis of apoptosis.As a important signal molecular,the concentration of Ca2closely related to cell apoptosis.

cell apoptosis;mechanism mitochondria membrane potential;flow cytometry

S852.3

A

1007-5038(2011)08-0089-04

2011-02-13

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-38)建設專項資金資助;公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項基金資助(201003060);華中農(nóng)業(yè)大學自主創(chuàng)新基金項目資助(2010QC002)

張廣智(1983-),男,河北衡水人,碩士研究生,主要從事反芻動物傳染性疾病子研究。