狂犬病病毒致神經(jīng)功能異常機制的研究進展*

單晶輝,關振宏,段 銘,張茂林

(人獸共患病研究教育部重點實驗室 吉林大學人獸共患病研究所,吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062)

狂犬病病毒致神經(jīng)功能異常機制的研究進展*

單晶輝,關振宏,段 銘,張茂林*

(人獸共患病研究教育部重點實驗室 吉林大學人獸共患病研究所,吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062)

狂犬病是一種以神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的高度致死性人獸共患病毒性傳染病,危害大,但其致病機制尚不明確?？袢〔《?RV)G蛋白與神經(jīng)細胞表面受體發(fā)生特異性結(jié)合決定其嗜神經(jīng)特性,其他RV結(jié)構(gòu)蛋白對RV感染具有保護和調(diào)節(jié)作用;機體感染RV后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和機體內(nèi)與功能相關的部分蛋白及基因表達水平發(fā)生改變,而且RV在神經(jīng)核的分布可能影響神經(jīng)通路的正常功能,推斷這些變化可能是出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和造成動物死亡的主要原因。論文綜述了RV感染導致神經(jīng)功能異常的研究近況,以期為闡明RV致神經(jīng)功能異常機理奠定基礎。

狂犬病病毒;神經(jīng)功能異常;致病機制

*通訊作者

狂犬病病毒(Rabies virus,RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus),是單股不分節(jié)負鏈 RNA。血清學方法將狂犬病病毒屬分為4個血清型,Ⅰ型病毒有古典RV、街毒和疫苗株,血清Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型病毒為狂犬病相關病毒,其原型株分別為Lagos bat、Mokola和 Duvenhage病毒。狂犬病每年約造成全球超過55 000人死亡[1]。我國人狂犬病流行的主要原因是養(yǎng)犬數(shù)量多,而犬免疫覆蓋率較低;RV感染犬的廣泛存在成為我國人狂犬病的主要傳染源[2]。感染者一旦發(fā)病,可表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀[3]。RV糖蛋白可與神經(jīng)細胞表面受體特異性結(jié)合,因此RV具有神經(jīng)嗜性,可以在肌肉-神經(jīng)元之間傳播。推斷由于RV對細胞表面受體的影響,導致神經(jīng)細胞受體的濃度發(fā)生改變,進而影響神經(jīng)功能;還可能導致細胞離子通道紊亂,從而影響神經(jīng)元的生理并進一步導致神經(jīng)元功能性損傷。神經(jīng)嗜性、神經(jīng)侵襲性及神經(jīng)功能損傷不僅是RV感染的顯著特征,也是病毒引起病理變化的基礎。由于缺乏對RV致神經(jīng)功能異常機制的準確認識,最終發(fā)病者幾乎100%死亡,因此對RV感染導致神經(jīng)功能異常機制的研究,不僅可加深對該病的認識,而且可為發(fā)病者的臨床干預提供重要依據(jù)。

1 細胞表面受體介導RV感染

RV G蛋白識別神經(jīng)細胞表面受體,可以在肌肉-神經(jīng)元之間傳播,因此RV具有神經(jīng)嗜性。乙酰膽堿受體(Nicotinic AcetylcholineReceptor,nAChR)、神經(jīng)細胞黏附分子(Neural Cell Adhesion Molecule,NCAM)、低親合力神經(jīng)營養(yǎng)因子p75受體(p75 Neurotrophin Recepter,p75NT R)可能是介導RV感染機體的細胞表面受體[4]。細胞表面受體的濃度和親合力的變化影響RV的感染。

nAChR是最先被確定的與RV感染有關的受體。nAChR位于神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜,并不是病毒最初進入運動神經(jīng)元的受體,其主要作用是使RV富集在神經(jīng)-肌肉接頭處,以更有效的感染運動神經(jīng)元[5]。RV敏感動物,如紅狐,其肌肉中nAChR的濃度遠高于對RV不敏感的負鼠,但這兩種動物的細胞受體對病毒的親和力差別不大。在體外培養(yǎng)時,nAChR頡頏劑可降低 RV在細胞上的增殖滴度,但不能完全抑制RV對該細胞的感染[6]。

研究證實正常不感染RV的細胞株在表達NCAM后可感染 RV,經(jīng)NCAM特異性抗體和NCAM的配體處理后病毒感染量減少。NCAM基因缺失的小鼠感染病毒后雖然發(fā)病延遲,但仍然易感,表明此受體雖然并非病毒感染的必須受體,但在感染過程中有作用[7]。

p75NT R受體介導RV感染機體的功能尚不明確。與NCAM類似,不感染RV的細胞株在表達p75NT R后可感染RV,但p75NT R缺失鼠和野生鼠的疾病級數(shù)并無區(qū)別。此外,在體外只有25%表達p75NTR的初級背根神經(jīng)節(jié)可感染 RV,表明p75NT R可能只是RV結(jié)合其他細胞表面分子的基礎[8]。碳水化合物、神經(jīng)節(jié)糖苷、類脂也可能參與RV侵入,但功能尚不確定。

2 RV結(jié)構(gòu)蛋白影響其致病性

RV的結(jié)構(gòu)蛋白由糖蛋白G、核蛋白N、基質(zhì)蛋白M、磷蛋白P和聚合酶蛋白L構(gòu)成。

G蛋白在囊膜上構(gòu)成病毒刺突,是 RV的表面蛋白,可結(jié)合細胞受體,介導病毒侵入,決定病毒的致病性和組織嗜性。研究表明,G蛋白上第333位精氨酸發(fā)生突變后,嚴重降低了RV對神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲力[9],G蛋白胞漿端的正確結(jié)構(gòu)及其完整性介導RV與胞漿膜上受體結(jié)合及以pH值依賴的方式內(nèi)吞。高水平表達RV G蛋白的重組狂犬病病毒,可加速被感染細胞發(fā)生凋亡,并激發(fā)機體的免疫應答,導致該重組病毒經(jīng)外周接種時致病性降低[10]。此外,G蛋白與RV強、弱毒株誘導凋亡的機制有關。弱毒株的G蛋白比強毒株的G蛋白不僅能更有效地誘導被感染細胞發(fā)生依賴Caspase凋亡,而且還可激發(fā)由凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)參與的非依賴Caspase的凋亡,但后者可被Bcl-2的過量表達所阻斷[11]。神經(jīng)致病性 RV可能通過病毒G基因低水平表達及干擾促凋亡因子的激發(fā),減弱對被感染神經(jīng)元的破壞,有利于RV在神經(jīng)元中的增殖及擴散,而缺失G蛋白的重組狂犬病病毒不能在神經(jīng)元間擴散。Préhaud C等[12]發(fā)現(xiàn)G蛋白胞漿區(qū)PDZ結(jié)合位點(PDZ-BS)的單一氨基酸改變可引起感染的神經(jīng)元發(fā)生凋亡,并使胞漿區(qū)G蛋白與PDZ結(jié)合的細胞互作因子相互作用,尤其是酪氨酸磷酸酶PT PN4。敲除PTPN4,病毒介導的凋亡作用消失。因此,推斷 RV毒力的衰減需要宿主PDZ蛋白與G蛋白相互作用。

N蛋白基因序列相對恒定,點突變較少,是病毒中最穩(wěn)定的蛋白。N蛋白是一個磷酸化蛋白,C端Ser389為磷酸化位點,N蛋白的磷酸化能調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復制。N蛋白與RV基因組RNA結(jié)合,形成核糖核蛋白復合體RNP,保護病毒RNA免遭核酸酶破壞[13]。

P蛋白含多個磷酸化位點,富含Thr和Ser殘基。P蛋白主要作為輔助因子,通過與L蛋白相互作用構(gòu)成具有活性的RNA聚合酶,并具有調(diào)節(jié)病毒RNA的復制和病毒包裝的功能。有研究表明,P蛋白通過與細胞動力蛋白輕鏈8(dynein light chain 8,LD8)相互作用,促進病毒RNA轉(zhuǎn)錄[14]。P蛋白對RV致病性的影響表現(xiàn)為:①LC8為動力輕鏈蛋白,在P蛋白上缺失LC8結(jié)合區(qū)的重組病毒,盡管不能阻止RV侵入神經(jīng),但影響該病毒的早期轉(zhuǎn)錄和復制;②RV感染細胞后,誘導細胞產(chǎn)生干擾素,干擾素抑制病毒的復制,但P蛋白可以影響干擾素的信號傳導通路,從而抑制干擾素的作用[15]。

M蛋白在病毒顆粒中發(fā)揮著連接病毒囊膜和核衣殼的作用,可以調(diào)控病毒RNA的復制及病毒的組裝,在病毒裝配和出芽過程中起關鍵作用。減少M蛋白的表達或增加M蛋白的異源性表達均能導致病毒的轉(zhuǎn)錄水平增加[16]。

L蛋白是一種多功能蛋白,負責病毒基因組復制、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工,包括起始轉(zhuǎn)錄、延伸、甲基化、加帽和polyA的形成。

3 RV感染導致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及基因表達水平改變

3.1 RV引起神經(jīng)元的病理變化

RV強毒株感染在發(fā)病早期導致神經(jīng)元功能異常,RV強毒株在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中幾乎不引起神經(jīng)元的凋亡和明顯的病理變化,但在發(fā)病晚期被感染動物表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀。鑒于RV致神經(jīng)功能異常機制的復雜性,Scott C A等[17]應用RV感染表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠,對瀕死期腦組織銀染發(fā)現(xiàn),在大腦皮質(zhì)第V層椎體細胞的樹突和軸突、小腦苔狀纖維及腦干軸突出現(xiàn)串珠和斷裂,在大腦皮質(zhì)和海馬椎體神經(jīng)元的核周和近端樹突,可觀察到由腫脹的線粒體形成的空泡。在瀕死期之前,當小鼠發(fā)生后肢麻痹時,串珠出現(xiàn)在小腦聯(lián)合的少數(shù)軸突,推斷這些變化可能是造成小鼠死亡和出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的原因。

3.2 感染RV導致功能相關的部分蛋白及基因的表達水平發(fā)生改變

FUIF等[18]研究了野生型RV感染小鼠的蛋白組變化,發(fā)現(xiàn) Na+/K+ATPase和 H+ATPase上調(diào),而 Ca2+ATPase及 α-SNAP、突觸融合蛋白-18和pallidin等涉及突觸小泡與突觸前膜錨定和融合相關的蛋白下調(diào),并在突觸前膜觀察到大量突觸小泡聚集,推斷可能是這些變化導致了神經(jīng)功能異常。ü bol S等[19]應用犬RV野毒株感染鼠,利用基因芯片從瀕死期腦組織中篩選到98個表達差異基因,這些基因涉及免疫、代謝、受體和傳輸、生長因子、死亡介導因子、轉(zhuǎn)錄和翻譯因子、蛋白酶及激酶等8類,而且發(fā)病期上調(diào)基因的數(shù)量較無癥狀期明顯增多,推斷是由于RV和細胞相互作用導致細胞內(nèi)環(huán)境的嚴重破壞,造成神經(jīng)功能障礙。

4 RV在神經(jīng)核的分布影響神經(jīng)通路的正常功能

按信息傳導方向?qū)⑸窠?jīng)傳導通路可分為上行通路、下行性通路和環(huán)形通路等3種。上行性神經(jīng)通路為感覺神經(jīng)通路,下行性神經(jīng)通路為運動通路,環(huán)形通路調(diào)控隨意運動、情緒及運動發(fā)生后的及時中止等。Kelly R M等[20]將CVS接種于懸猴的前臂,免疫組化顯示該病毒從注射部位擴散到丘腦的一級神經(jīng)元,然后進入位于小腦半球髓質(zhì)深部齒狀核的二級神經(jīng)元,最后從齒狀核進入小腦皮質(zhì)的蒲氏細胞(三級神經(jīng)元),該感染過程指示了一條RV感染小腦的通路及三級神經(jīng)元間的聯(lián)系。將CVS分別接種到猴近前肢,遠前肢、后肢和口頜面部,通過檢測紋狀體和下丘腦核中的RV,證實由背殼核和下丘腦核參與的皮質(zhì)-基底核運動通路可形成獨立的閉合環(huán)路,并在海馬中出現(xiàn)大量的嗜酸性包涵體。Carrieri M L等[21]研究發(fā)現(xiàn),應用 RV通過外周感染海馬時,腦干和頸髓組織中抗原量遠高于海馬、大腦皮質(zhì)和小腦皮質(zhì),因此研究RV在感染腦組織中的分布以及所涉及的神經(jīng)通路及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的變化,可能是揭示RV導致神經(jīng)功能異常機制的有效手段。

5 RV可破壞血腦屏障

血腦屏障可以阻擋病原微生物和其他大分子物質(zhì)在外周和神經(jīng)組織之間的流動。Preuss M A R等[22]發(fā)現(xiàn)蝙蝠相關RV可通過侵入下丘腦神經(jīng)纖維經(jīng)血液進入大腦。在 RV感染病例,血腦屏障被破壞,中和抗體和其他免疫因子才能進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)以清除感染組織中的病毒。血腦屏障完整性被破壞與神經(jīng)組織中出現(xiàn)淋巴細胞和抗體以及炎性物質(zhì)有關系。Pleydell D R等[23]認為血腦屏障完整性的破壞是機體對抗嗜神經(jīng)病毒感染主要的保護性機制。

6 RV不同毒株侵染部位復制特性不同

人感染RV街毒潛伏期為20 d～90 d,很少短于幾天或多于1年[24],巨噬細胞可能起隔絕病毒的作用,致使?jié)摲谙鄬^長[25]。應用來源于花紋臭鼬唾液腺的街毒株通過肌肉接種9只臭鼬,在臨床癥狀出現(xiàn)之前,其中4只于接種部位的外展肌纖維和個別肌細胞中,RT-PCR和免疫組化均呈陽性,但接種62 d～64 d后的脊神經(jīng)或脊索呈陰性,說明RV在接種部位的肌組織中發(fā)生了復制,但還不清楚感染的肌纖維是否是RV侵入外周神經(jīng)的關鍵;在小鼠模型中,應用RV街毒株肌肉接種,未檢測到肌肉或其他神經(jīng)外組織的早期感染[26]。CVS給成年鼠肌肉接種,接種后6 h～30 h間未在咬肌中發(fā)現(xiàn)病毒特異性RNA,但在接種后第18 h和第24天分別在三叉神經(jīng)節(jié)和腦干中檢測到RV基因組[27],提示RV沒有在神經(jīng)外組織復制即直接侵入神經(jīng)。RV是否在所有感染動物的外周組織中復制及其復制是否是RV侵染外周神經(jīng)的關鍵尚不確定。

7 結(jié)語

狂犬病是人畜共患的急性傳染病,全世界有100多個國家受狂犬病危害,每年約有55 000人死于狂犬病,病死率極高,全世界僅有數(shù)例存活的報告。盡管已經(jīng)對狂犬病進行了廣泛的臨床和病理學研究,但其潛在的致病機理尚不確定。病毒復制、分布及在體內(nèi)的擴散途徑等,這些都和發(fā)病機理相關。除了這些機制,狂犬病常出現(xiàn)的特有癥狀如不眠癥、狂躁、吞咽困難、恐水等癥狀與RV感染對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響之間的關系,是揭示RV致病的關鍵機制,RV侵染外周神經(jīng),進一步破壞血腦屏障的完整性,進入CNS侵染神經(jīng),分布于不同的神經(jīng)核,影響神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及某些神經(jīng)通路的正常功能,導致部分蛋白及基因的表達水平、細胞表面受體濃度等發(fā)生改變,推斷這些變化是造成RV神經(jīng)癥狀的可能因素。對RV感染導致神經(jīng)功能異常機制的理解不僅可加深對該病的認識,而且可為臨床干預提供重要依據(jù)。

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Progress on the Pathogenesis of Neuronal Dysfunction Due to Rabies Virus Infection

SHAN Jing-hui,GUAN Zhen-hong,DUAN Ming,ZHANG Mao-lin*

(Key laboratory of Zoonosis,Ministry of Education,Institute of Zoonosis,College of Animal Science and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,J ilin130062,China)

Rabies is a highly contagious lethal zoonosis caused by rabies virus,which is characterized as the neurotropic infection.Many works had focused on it,however,its pathogenesis remains unclear.G protein of rabies virus(Rabies Virus,RV)interacting with nerve cell surface receptors to determine their neurotropic specific binding characteristics,other structural proteins of RV play an important role in protecting and regulating of RV,RV could significantly change the neuronal structures and the expression levels of some proteins and genes that are associated with function,and the distribution of RV in the nucleus may affect the normal function of neuronal pathways,all of those might determine clinical symptoms and deaths.This issue reviews the progresses in RV pathogenesis,hope to provide some light on neuronal dysfunction.

Rabies virus;neurological dysfunction;pathogenesis

S852.659.1

A

1007-5038(2011)08-0066-04

2010-12-14

國家自然科學基金項目(31072147);吉林省科技發(fā)展計劃重點項目(20100954;20080930);國家科技支撐(2008BAB96B11-3)

單晶輝(1987-),女,碩士研究生,主要從事抗病毒性免疫子研究。