大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

董彥琪，原連莊，吳濤，原讓花，肖艷

（河南新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，453003）

大白菜（Brassicacampestris ssp.pekinensis（Lour.）Olsson）是一種原產(chǎn)于我國的重要蔬菜作物，屬十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，在我國秋冬季蔬菜的生產(chǎn)與供應(yīng)中居主導(dǎo)地位，是我國栽培面積最大、產(chǎn)量最高的蔬菜作物。大白菜為異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，目前主要采用常規(guī)自交的方法選育雜交種親本系，此法所需年限較長(zhǎng)，要育成純合的可利用親本需要5~7 a時(shí)間。游離小孢子培養(yǎng)（isolated microspore culture，IMC） 技術(shù)是一種新興的生物技術(shù)，它具有單細(xì)胞、單倍體和較高胚胎發(fā)生率及較高同步性等特點(diǎn)。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以迅速獲得雙單倍體（doubled haploid，DH）純合植株，進(jìn)而獲得純合親本系，2~3 a便可獲得完全純合的等基因純系，大大加快了育種進(jìn)程。20世紀(jì)80年代末期，日本學(xué)者Sato等[1]首次通過游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得了春性早熟型大白菜的小孢子胚和再生植株；20世紀(jì)90年代初期，我國許多學(xué)者開展了大白菜游離小孢子培養(yǎng)[2~5]。此后，國內(nèi)外學(xué)者在影響大白菜小孢子胚形成因素和小孢子胚發(fā)生機(jī)制、小孢子植株再生和加倍機(jī)制及游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)踐應(yīng)用等方面做了大量有意義的探索，并取得了許多重要的研究進(jìn)展。

1 影響大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的因素

1.1 供試材料對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

①基因型 基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生率的關(guān)鍵性因素?；蛐蛯?duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生能力的決定作用體現(xiàn)在2個(gè)方面：a.基因型的反應(yīng)范圍。曹鳴慶等[2]、栗根義等[4]、蔣武生等[6]均認(rèn)為大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生能力較強(qiáng)，能成胚的基因型分別為94.12%，92.31%和87.50%；許艷輝等[7]的試驗(yàn)結(jié)果則顯示大白菜游離小孢子能成胚的基因型比率較低，僅為18.92%。b.胚胎發(fā)生頻率（產(chǎn)胚率）的差異。許多研究結(jié)果表明，不同基因型大白菜的胚狀體發(fā)生能力有明顯差異[2，4，6~14]；四倍體大白菜植株的游離小孢子培養(yǎng)同樣證明基因型對(duì)小孢子胚胎的發(fā)生能力有顯著影響[15]。姜立榮等[16]的研究表明，大白菜小孢子胚胎發(fā)生能力同其他遺傳性狀一樣，是一種受基因調(diào)控的遺傳特性[16]，基因型是影響大白菜小孢子胚胎發(fā)生啟動(dòng)與否的內(nèi)在因素[17]。

大白菜小孢子胚胎的發(fā)生能力還與植株類型有一定的相關(guān)性。劉凡等[18]報(bào)道疊抱型大白菜的小孢子產(chǎn)胚率高于合抱型，早熟型的產(chǎn)胚率高于中、晚熟型；方淑桂等[19]報(bào)道擰抱炮彈型大白菜小孢子胚誘導(dǎo)率和胚產(chǎn)量高于疊抱頭球型。

②外部環(huán)境 供體植株生長(zhǎng)的溫度條件是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因子。一般從發(fā)育健壯的植株上取花蕾進(jìn)行培養(yǎng)效果較好?，F(xiàn)蕾期植株處于較低溫度條件下，晝夜溫度為10~25℃，胚狀體產(chǎn)量較高[3]。日照長(zhǎng)度對(duì)小孢子產(chǎn)胚量也有一定影響，長(zhǎng)日照（14~18 h）和低溫（15~20℃）條件下的植株胚狀體發(fā)生數(shù)及植株再生率高[7]。方淑桂等[9]的研究表明，供體植株采蕾期的氣溫條件是小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素，采蕾前3 d的氣溫為14℃/24℃（夜/晝）時(shí)最適宜小孢子發(fā)育。因此，在無人工氣候室的情況下，宜在春季（3~4月）進(jìn)行大白菜小孢子培養(yǎng)，以避開秋季日照短、溫度高等不利小孢子培養(yǎng)的環(huán)境[15]。

③生理狀況 供體植株的株齡和花序齡對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響不同。申書興等[15]的研究表明，株齡對(duì)二倍體和四倍體大白菜品種的小孢子胚胎發(fā)生率影響顯著，盛花期是進(jìn)行大白菜小孢子培養(yǎng)的適宜時(shí)期。方淑桂等[9]的研究表明，盛花期的花蕾和供體植株的營養(yǎng)狀況良好，有利于胚胎發(fā)生及植株再生。軒正英等[20]的研究表明，株齡對(duì)胚誘導(dǎo)率有一定影響，在盛花期和末花期采集花蕾進(jìn)行大白菜游離小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率最高。周英等[10]的研究表明，盛花期大白菜小孢子的出胚率高于初花期和末花期，張亞麗等[13]和王秀英等[21]的研究結(jié)果與其相同，王秀英等還進(jìn)一步指出下午取蕾優(yōu)于上午。

1.2 孢子對(duì)小孢子胚發(fā)育的影響

①發(fā)育時(shí)期 選擇發(fā)育時(shí)期合適的花粉是提高大白菜花粉誘導(dǎo)頻率的重要措施。胚胎發(fā)生的激發(fā)啟動(dòng)大致發(fā)生在單核中期至單核靠邊期這一短暫的發(fā)育過程中[1，16]，該時(shí)期小孢子的最大特征是有1個(gè)大的占整個(gè)細(xì)胞體積50%以上的中央液泡，細(xì)胞核被擠壓至靠近細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)相對(duì)不透明，其內(nèi)含有豐富的核糖體，大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體等隨機(jī)分布于細(xì)胞內(nèi)。與二倍體植株相似，四倍體大白菜的小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)胚胎產(chǎn)率有顯著影響，單核靠邊期小孢子占多數(shù)時(shí)胚胎產(chǎn)量最高[15，17]。曹鳴慶等[3]研究發(fā)現(xiàn)，花蕾長(zhǎng)與小孢子發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。當(dāng)CC11基因型大白菜的花蕾長(zhǎng)2.0~2.5 mm時(shí)，處于單核中期的小孢子占41.7%，處于單核靠邊期的小孢子占58.3%，此時(shí)小孢子胚胎產(chǎn)量最高。鄒金美[17]的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果表明,當(dāng)花蕾長(zhǎng)為2.0~3.0 mm、花瓣與花藥長(zhǎng)度比為1/2~4/5時(shí)，50%~70%的小孢子處于單核靠邊期，此條件最宜進(jìn)行大白菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)。花蕾大小還與接種材料的栽培條件有關(guān)，如在接種溫室栽培的F1代材料的花蕾長(zhǎng)為6~7 mm時(shí)，小孢子仍處于單核晚期，但生長(zhǎng)在大田的大白菜植株進(jìn)行花藥和小孢子培養(yǎng)的合適花蕾長(zhǎng)僅為2~4 mm。因此，應(yīng)結(jié)合細(xì)胞學(xué)與植物學(xué)特征確定取材時(shí)間和取樣大小。

②接種濃度 接種濃度是影響小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素之一，小孢子濃度過高和過低均不利于胚的發(fā)育。濃度過高時(shí)，其會(huì)消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，并且釋放許多有害物質(zhì)，影響胚的發(fā)育；小孢子發(fā)育需要群體效應(yīng)，濃度過低同樣不利于小孢子胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。一般認(rèn)為小孢子密度為2×104~4×104個(gè)/mL最合適，而最近的研究表明，接種濃度為 1×105~2×105個(gè)/mL 最合適[22]。

1.3 培養(yǎng)基成分對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

①基本培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，其不僅影響小孢子細(xì)胞的分裂，而且對(duì)胚狀體再生植株的過程也有重要的影響。栗根義等[5]用改良的Lichter培養(yǎng)液、日本學(xué)者Sato等[1]采用大量元素減半的 NLN（Nitsch and Nitsch）培養(yǎng)基、張鳳蘭等[8]采用BM培養(yǎng)基進(jìn)行了大白菜游離小孢子培養(yǎng)。近年來，許多學(xué)者采用NLN基本培養(yǎng)基進(jìn)行了大白菜游離小孢子培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果較其他培養(yǎng)基大大提高[3，4，6，9，19~21]。 也可采用 NLN 基本培養(yǎng)基進(jìn)行四倍體大白菜的游離小孢子培養(yǎng)[15]。

②蔗糖 進(jìn)行大白菜游離小孢子培養(yǎng)時(shí)多以蔗糖作碳源。蔗糖不但能提供小孢子生長(zhǎng)所需的能量，而且還能維持細(xì)胞的滲透壓。蔣武生等[23]比較了不加任何激素但添加不同濃度蔗糖的NLN培養(yǎng)基進(jìn)行小白菜游離小孢子培養(yǎng)的效果，結(jié)果表明蔗糖濃度為13%時(shí)培養(yǎng)效果較好，可為大白菜游離小孢子培養(yǎng)提供參考。也有研究選擇10%和17%的蔗糖濃度，結(jié)果表明，高濃度的蔗糖可保持小孢子的活力，而低濃度的蔗糖能促進(jìn)小孢子的分裂及發(fā)育。

③外源激素 大白菜游離小孢子培養(yǎng)中，外源激素對(duì)其胚的形成和植株再生的影響尚未取得一致的結(jié)果。軒正英等[20]的研究表明，在培養(yǎng)基中加入6-BA能明顯促進(jìn)胚狀體的發(fā)生，6-BA濃度為0.05 mg/L時(shí)胚產(chǎn)量最高；張亞麗等[13]和付文婷等[14]的研究認(rèn)為，6-BA對(duì)胚狀體的發(fā)生和發(fā)育有促進(jìn)作用，6-BA的適宜濃度為0.2 mg/L；徐艷輝等[8]也報(bào)道，6-BA對(duì)大白菜的小孢子胚胎發(fā)生有一定的促進(jìn)作用，最佳濃度為0.2 mg/L，但是對(duì)難成胚的基因型，6-BA的作用不大。韓陽等[24]的研究認(rèn)為6-BA的最適濃度為0.4 mg/L，而NAA的濃度為0.10~1.00 mg/L時(shí)，抑制大白菜小孢子胚的發(fā)生，且濃度越高，其抑制作用越大。另外，在進(jìn)行四倍體大白菜的小孢子培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0~1.0 mg/L時(shí)，大白菜小孢子胚的發(fā)生頻率均較高，但當(dāng)NAA濃度高于2.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)抑制作用；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為0.05~0.20 mg/L時(shí)，大白菜小孢子的產(chǎn)胚率高，但當(dāng)6-BA濃度超過0.4 mg/L時(shí)出現(xiàn)抑制作用[15]。

耿建峰等[11]的研究表明，6-BA和NAA對(duì)大白菜小孢子胚的誘導(dǎo)率影響不大，但添加濃度過大時(shí)小孢子胚的誘導(dǎo)率降低。蔣武生等[6]的研究表明添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基對(duì)大白菜小孢子的胚胎發(fā)生具有抑制作用。韓陽等[24]研究認(rèn)為，較低濃度的細(xì)胞分裂素能促進(jìn)胚狀體的發(fā)生，且6-BA的作用大于ZT，ZT的最適濃度為0.2 mg/L；2，4-D對(duì)大白菜小孢子胚的形成有較強(qiáng)的抑制作用。

④活性炭 在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭可以加快培養(yǎng)進(jìn)程，提高大白菜小孢子胚產(chǎn)量、子葉形胚率及胚狀體發(fā)育的同 步性[7，15，18，25~27]，但添 加 活性炭濃度不盡一致。徐艷輝等[7]報(bào)道，0.01~0.02 g/L活性炭可明顯促進(jìn)大白菜小孢子胚狀體的形成。申書興等[15，25]的研究發(fā)現(xiàn)，添加 0.05~0.10 g/L活性炭對(duì)二倍體及四倍體大白菜小孢子胚生率和發(fā)育的同步性均有明顯的促進(jìn)作用；孫丹等[26]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加0.10 g/L活性炭能增加大多數(shù)大白菜品種的小孢子胚產(chǎn)量，原因可能是適量的活性炭吸附了培養(yǎng)基中對(duì)胚產(chǎn)生具有毒害作用的物質(zhì)。蔣武生等[27]的研究表明，0.50 g/L活性炭有利于大白菜小孢子胚的誘導(dǎo)和形成。劉凡等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加1.40 g/L活性炭后，一些原本無胚狀體形成的大白菜材料有胚狀體形成，原本僅能形成較少胚狀體的材料產(chǎn)生了較多的胚狀體，但個(gè)別材料得不到胚或只能得到1至數(shù)個(gè)不能正常發(fā)育的胚；而韓陽等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的活性炭對(duì)大白菜小孢子胚的發(fā)生表現(xiàn)出抑制作用。

1.4 培養(yǎng)技術(shù)對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

①低溫（冷擊）預(yù)處理 溫度在誘導(dǎo)小孢子產(chǎn)生胚狀體培養(yǎng)條件中占有重要地位。培養(yǎng)前低溫預(yù)處理花蕾，對(duì)大白菜小孢子的胚胎發(fā)生有一定的影響。Sato等[28]報(bào)道冷擊預(yù)處理花蕾能提高大白菜小孢子胚發(fā)生率。軒正英等[20]的研究表明，花序在4℃下處理1~2 d后，大白菜小孢子的誘導(dǎo)率明顯提高。路翠玲等[29]也得到了同樣結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)以未經(jīng)低溫處理或處理時(shí)間過長(zhǎng)的花蕾進(jìn)行培養(yǎng)，其胚狀體的誘導(dǎo)率較低。耿建峰等[11]的研究表明，低溫處理花蕾0~5 d，大白菜小孢子胚的誘導(dǎo)率差異不大，超過5 d其胚的誘導(dǎo)率則明顯降低。

②高溫（熱激）預(yù)處理 當(dāng)大白菜小孢子被接種到培養(yǎng)基上后，需用高溫啟動(dòng)和誘導(dǎo)小孢子發(fā)育過程的改變，即從配子體發(fā)育過程轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育過程。栗根義等[4，5]認(rèn)為，35℃高溫預(yù)處理對(duì)大白菜游離小孢子胚狀體的誘導(dǎo)很重要，其作用機(jī)制可能是通過改變小孢子的發(fā)育途徑，阻止了小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，促使其沿胚胎發(fā)育途徑發(fā)展，最后形成小孢子胚。

姜立榮等[16]認(rèn)為，以35℃高溫誘導(dǎo)時(shí)，大白菜小孢子進(jìn)行第1次細(xì)胞分裂的方式多種多樣，但對(duì)稱分裂方式占優(yōu)勢(shì)。劉公社等[30]應(yīng)用FDA和DAPI熒光顯微技術(shù)，觀察了高溫處理對(duì)大白菜小孢子培養(yǎng)的影響，研究結(jié)果表明，在33℃高溫下預(yù)處理24 h，然后轉(zhuǎn)入25℃條件下培養(yǎng)，雖然小孢子第1天的成活率急劇下降，但隨后仍保持一定水平；且膨脹后的小孢子多呈圓球形，以對(duì)稱分裂方式為主；小孢子經(jīng)多次分裂可形成緊密的多細(xì)胞團(tuán)，最終形成胚狀體。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子主要發(fā)育途徑為B途徑，在33℃高溫下預(yù)處理24 h后，單倍體小孢子體積膨大，染色體自然加倍，激發(fā)小孢子進(jìn)入孢子體發(fā)育途徑。

趙冰等[32]的研究表明，在33℃高溫下預(yù)處理24 h對(duì)增加不同基因型大白菜材料的出胚量存在明顯差別，誘導(dǎo)效率越高的基因型對(duì)高溫的反應(yīng)越敏感，出胚量增加的也越多。蔣武生等[6]研究發(fā)現(xiàn)，較易誘導(dǎo)產(chǎn)生胚的基因型，33℃高溫下處理24 h對(duì)胚誘導(dǎo)率的效果最好，而對(duì)于難誘導(dǎo)產(chǎn)生胚的基因型在33℃高溫下處理48 h后的胚誘導(dǎo)率較高。劉公社等[30]認(rèn)為大白菜小孢子培養(yǎng)的高溫預(yù)處理時(shí)間應(yīng)因基因型而異，一般應(yīng)在24~48 h；若以高溫誘導(dǎo)處理后的小孢子分裂頻率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，小孢子接受高溫處理的敏感期處于開始培養(yǎng)的12 h內(nèi)；若以胚胎發(fā)生為評(píng)價(jià)指標(biāo)，敏感期處于開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)。

③振蕩培養(yǎng) 大白菜游離小孢子培養(yǎng)以固體和液體培養(yǎng)方式為主。一般液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)容易被小孢子吸收，但其透氣性較差，會(huì)導(dǎo)致褐色胚的產(chǎn)生。申書興等[25]將培養(yǎng)14 d的大白菜小孢子置于搖床上培養(yǎng)（60 r/min）7 d，結(jié)果表明，振蕩培養(yǎng)改善了培養(yǎng)基的通氣性，促進(jìn)原胚迅速發(fā)育成子葉型胚，提高了子葉胚率和胚狀體發(fā)育的同步性，同時(shí)促進(jìn)小孢子胚直接成苗。趙俊等[33]報(bào)道低頻振蕩（80 r/min）極大地提高出了大白菜小孢子的出胚數(shù)。

2 影響小孢子胚植株再生的因素

2.1 胚狀體發(fā)育階段

在早期的研究中，大白菜小孢子胚胎植株成苗率很低，只有5%~10%[1]。大白菜小孢子胚的植株再生受基因的影響，再生能力強(qiáng)的基因型易形成小孢子胚再生植株，但處于不同發(fā)育階段的同一基因型的小孢子胚的成苗率差異很大，子葉期的胚具有迅速再生成苗的能力，魚雷期的胚則較難成苗，處于球形期和心形期的胚則發(fā)育停滯。曹鳴慶等[2]的研究表明，心形期至魚雷期的胚胎移植后半數(shù)以上發(fā)育為幼苗，其中5%~10%為白化苗。韓陽等[34]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的子葉形胚的成苗率可達(dá)20%；子葉已擴(kuò)大的萌發(fā)胚成苗率可達(dá)90%以上；發(fā)育早期的胚較難成苗，尤其是心形胚和球形胚其成苗率均為0。

2.2 小孢子胚在液體培養(yǎng)基中的滯留時(shí)間

成熟的大白菜小孢子胚在NLN-13培養(yǎng)基中滯留的時(shí)間對(duì)其植株再生影響很大。劉凡等[18]的研究表明，將在液體培養(yǎng)基中滯留14 d和21 d的小孢子胚轉(zhuǎn)移至MS0固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)56 d時(shí)，其成苗率分別達(dá)到85%和81.6%，而停留28 d和35 d的小孢子胚最終的成苗率只有63.3%和42.7%，大大低于前兩者。

2.3 固體培養(yǎng)基中的水分含量

許多研究表明，增加固體培養(yǎng)基中的瓊脂含量可降低培養(yǎng)基的含水量，進(jìn)而提高大白菜小孢子胚狀體的再生植株率。韓陽等[34]的研究表明，大白菜小孢子胚成熟后需要較干燥的生長(zhǎng)環(huán)境，因此及時(shí)將成熟的子葉期胚轉(zhuǎn)入相對(duì)干燥的培養(yǎng)環(huán)境有利于植株再生；當(dāng)培養(yǎng)基中的瓊脂含量為1.2%時(shí)，最有利于大白菜小孢子胚成苗，再生株率為50.5%。劉凡等[35]以含瓊脂1.2%的MS0培養(yǎng)基處理的大白菜小孢子胚的死胚數(shù)最少，再生植株成苗率最高，達(dá)到85.8%。申書興等[25]在進(jìn)行四倍體大白菜小孢子培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，再生植株成苗率與培養(yǎng)基的水分含量有關(guān)，適宜胚狀體成苗的培養(yǎng)基是B5+3%蔗糖+1.2%瓊脂。據(jù)蔣武生等[23]報(bào)道，有利于大白菜小孢子胚成苗的培養(yǎng)基為B5+0.2 mg/L 6-BA+3%蔗糖+1%瓊脂。

2.4 活性炭

劉凡等[18]的研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)活性炭處理獲得的大白菜胚狀體在光照下轉(zhuǎn)綠、萌發(fā)、成苗等方面的能力均不及未經(jīng)活性炭處理的。原因可能是活性炭的吸附作用無選擇性，當(dāng)其濃度超過適宜濃度后，在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時(shí)，也吸附了其中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與胚生長(zhǎng)和分化密切相關(guān)的物質(zhì)。因此培養(yǎng)基中的活性炭濃度不宜太高，否則會(huì)起負(fù)作用。

韓陽等[34]的研究表明，培養(yǎng)基中添加活性炭的處理比不含活性炭的成苗率高20%~122.5%，其中添加200 mg/L活性炭的培養(yǎng)基最有利于大白菜小孢子胚的成苗。

3 小孢子胚的繼代、生根和移栽

蔣武生等[23]的研究表明，大白菜小孢子胚在繼代培養(yǎng)基B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA上可每25~30 d繼代1次。小孢子胚再生出芽后，將高度為3~5 cm的健壯苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基MS+0.10 mg/L NAA上形成完整植株，植株具4~5片葉時(shí)移入盛有田園土的營養(yǎng)缽中，7 d后即可生根，10~15 d后成活，成活率可達(dá)95%。付文婷等[14]的研究結(jié)果與之相似，其認(rèn)為B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA培養(yǎng)基有利于大白菜小孢子胚發(fā)育成植株，1/2 MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基最適宜大白菜小孢子植株生根。徐艷輝等[7]研究了KT和6-BA對(duì)大白菜小孢子胚再生植株的影響，結(jié)果表明，將小孢子胚接種在MS+0.8%瓊脂+3%蔗糖+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA的固體培養(yǎng)基上，2個(gè)基因型的小孢子胚再生植株無性擴(kuò)繁的成活率分別為82%和92.5%，繼代培養(yǎng)后的大白菜小孢子胚再生植株在1/2 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1 mg/L NAA上的生根培養(yǎng)基上生根良好，將已生根的再生植株移到1/2壤土+1/2糞土的盆中便可生長(zhǎng)。張亞麗等[13]的研究表明，B5培養(yǎng)基中附加0.10 mg/L GA3最有利于大白菜小孢子胚分化，1/2 MS培養(yǎng)基中附加0.10 mg/L NAA最適合大白菜小孢子胚再生植株生根。而周英等[10]的研究表明，培養(yǎng)基MS+0.10 mg/L NAA最適宜大白菜小孢子胚再生植株生根。

趙岫云等[36]的研究表明，大白菜小孢子胚植株再生能力的遺傳符合加性—顯性模式，即其主要受核基因控制，基因作用以加性效應(yīng)為主，高植株再生能力由隱性基因控制，其狹義遺傳力為70.6%。這一研究結(jié)果為改良小孢子胚植株再生能力差的大白菜材料提供了一條有意義的途徑，即可選用小孢子胚植株再生能力強(qiáng)的材料與之雜交，提高后代的植株再生能力，從而獲得更多的再生植株。

4 小孢子植株的加倍技術(shù)

只有將小孢子培養(yǎng)所得到的再生植株的染色體加倍為二倍體，才能將其應(yīng)用于育種實(shí)踐。大白菜小孢子再生植株中出現(xiàn)DH植株的頻率不完全相同，但頻率均較高。曹鳴慶等[3]的研究結(jié)果表明，經(jīng)由小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的大白菜小孢子再生植株的自然加倍率在50%~70%。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子胚再生植株具有較高的自然加倍率，且其與小孢子培養(yǎng)時(shí)的熱激誘導(dǎo)密切相關(guān)。張鳳蘭等[7]的研究表明，春秋兩季大白菜品種的小孢子再生植株的自然加倍率不等，多數(shù)品種在70%，其還認(rèn)為由大白菜游離小孢子培養(yǎng)得到的再生植株有自然加倍成為二倍體的特點(diǎn)。這一研究結(jié)果為游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在大白菜育種工作中的有效利用提供了廣闊的前景。目前生產(chǎn)中主要用0.2~4.0 mg/g秋水仙堿處理再生的單倍體植株進(jìn)行人工加倍。

5 問題與展望

綜上所述，游離小孢子培養(yǎng)這一具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值的生物技術(shù)越來越受到科研工作者的重視，并已得到廣泛的應(yīng)用[37~46]。但其在應(yīng)用中還存在許多理論和實(shí)際問題，如在適宜條件下，通過游離小孢子培養(yǎng)，大多數(shù)基因型的大白菜可以獲得小孢子胚及再生植株，但也有少數(shù)基因型不能獲得小孢子胚及再生植株；且這一技術(shù)尚未達(dá)到隨意操作雄配子的程度；另外，在大白菜小孢子啟動(dòng)分裂的機(jī)理、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的理論研究還十分欠缺。

利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)能夠在較寬的基因型范圍內(nèi)以較高的胚狀體發(fā)生率獲得大白菜小孢子胚和再生植株，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到建立起完善、高頻的大白菜小孢子再生體系的程度。小孢子再生植株具有自然加倍成為二倍體的特點(diǎn)，在大白菜遺傳和育種研究方面具有十分誘人的應(yīng)用前景，但小孢子胚自然加倍成為二倍體的機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

今后應(yīng)加強(qiáng)理論研究和提高實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的工作，建立能穩(wěn)定、高效地獲得純合二倍體的游離小孢子培養(yǎng)體系，提高該技術(shù)在大白菜育種工作中利用的成功率和效率，并將其與傳統(tǒng)育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合，使之成為常規(guī)育種的一個(gè)重要組成部分。

[1]Sato T,Nishio T,Hirai M.Plant regeneration from isolated

microspore culture of Chinese cabbage(Brassica campestris ssp.pekinensis)[J].Plant Cell Rep,1989(8):486-488.

[2]曹鳴慶，李巖，蔣濤，等.大白菜和小白菜游離小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1992，7（2）：119-120.

[3]曹鳴慶，李巖，劉凡.基因型及供體植株生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993，8（4）：1-6.

[4]栗根義，高睦槍，趙秀山.大白菜游離小孢子培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào)，1993，20（2）：167-170.

[5]栗根義，高睦槍，趙秀山.高溫預(yù)處理對(duì)大白菜游離小孢子培養(yǎng)的效果（簡(jiǎn)報(bào)）[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1993，26（2）：165-166.

[6]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.提高大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)率的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（6）：34-37.

[7]徐艷輝，馮輝，張凱.大白菜游離小孢子培養(yǎng)中若干因素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)和植株再生影響[J].北方園藝，2001（3）：6-8.

[8]張鳳蘭，釘貫靖久，吉川宏昭.環(huán)境條件對(duì)白菜小孢子培養(yǎng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（l）：95-100.

[9]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)若干因素探討[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，19（4）：243-246.

[10]周英，馮輝，王超楠，等.大白菜小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（6）：816-820.

[11]耿建峰，侯喜林，張曉偉，等.影響白菜游離小孢子培養(yǎng)關(guān)鍵因素分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2007，34（1）：111-116.

[12]胡齊贊，龔亞明，韋順戀，等.大白菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)比較研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（5）：352-355.

[13]張亞麗，張魯剛，張華敏，等.早熟大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)及植株再生的研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（3）：45-49.

[14]付文婷，張魯剛，胥宇建，等.大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)及植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（3）：139-143.

[15]申書興，趙前程，劉世雄，等.四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（4）：232-237.

[16]姜立榮，劉凡，曹鳴慶.大白菜小孢子胚狀體發(fā)生早期的超微結(jié)構(gòu)研究[J].電子顯微學(xué)報(bào)，1996，15（5）：395.

[17]鄒金美.大白菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[18]劉凡，莫東發(fā)，姚磊，等.遺傳背景及活性炭對(duì)白菜小孢子胚胎發(fā)生能力的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9（3）：297-300.

[19]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究初報(bào)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，18（2）：123-126.

[20]軒正英，徐書法，馮輝，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)成胚影響因素的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：18-19.

[21]王秀英，巫東堂，趙軍良，等.影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)因素的研究[J].中國瓜菜，2009（2）：10-12.

[22]李維薇，藺忠龍，白現(xiàn)廣，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)最新研究進(jìn)展[J].北方園藝，2009（2）：133-135.

[23]蔣武生，原玉香，張曉偉，等.小白菜游離小孢子培養(yǎng)及其再生植株[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，39（4）：398-401.

[24]韓陽，葉雪凌，馮輝.大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究[J].中國蔬菜，2006（7）：16-18.

[25]申書興，梁會(huì)芬，張成合，等.提高大白菜小孢子胚胎發(fā)生及植株獲得率的幾個(gè)因素研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999（4）：65-68.

[26]孫丹，王濤濤，葉志彪，等.基因型和活性炭對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（6）：73-75.

[27]蔣武生，姚秋菊，張曉偉，等.活性炭和振蕩培養(yǎng)對(duì)提高大白菜胚誘導(dǎo)率的影響[J].中國瓜菜，2008（4）：1-3.

[28]Sato S,Katoh N,Iwai S.Effect of low temperature pretreatment of buds or inflorescence on isolated microspore culture in Brassica rapa(syn.B.campestris)[J].Breeding Science,2002,52:23-26.

[30]劉公社，李巖，劉凡，等.高溫對(duì)大白菜小孢子培養(yǎng)的影響[J].植物學(xué)報(bào)，1995，37（2）：140-146.

[31]李菲，張淑江，章時(shí)蕃，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生中的加倍機(jī)制[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（5）：974-978.

[32]趙冰，聞鳳英，王玉龍，等.青麻葉大白菜小孢子培養(yǎng)及新品種選育[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（2）：26-29.

[33]趙俊，巫東堂，趙軍良，等.影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)若干因素的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：26-28.

[34]韓陽，葉雪凌，馮輝.提高大白菜小孢子植株獲得率的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32（6）：1 092-1 094.

[35]劉凡，李巖，姚磊，等.培養(yǎng)基水分狀況對(duì)大白菜小孢子胚成苗的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1997，5（2）：131-136.

[36]趙岫云，張鳳蘭，徐家炳，等.大白菜游離小孢子胚再生植株能力的遺傳分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（2）：122-124.

[37]栗根義，高睦槍，楊建平，等.利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成豫白菜 7 號(hào)（豫園 1 號(hào)）[J].中國蔬菜，1998（4）：16-19.

[38]高睦槍，張曉偉，耿建峰，等.通過游離小孢子培養(yǎng)育成的優(yōu)質(zhì)大白菜新品種 ‘豫白菜12號(hào)’[J].園藝學(xué)報(bào)，2001，28（1）：88.

[39]耿建峰，原玉香，張曉偉，等.利用游離小孢子培養(yǎng)育成早熟大白菜新品種 ‘豫新5號(hào)’[J].園藝學(xué)報(bào)，2003，30（2）：249.

[40]原玉香，張曉偉，耿建峰，等.利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成早熟大白菜新品種‘豫新60’[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（5）：704.

[41]蔣武生，張曉偉，耿建峰，等.極早熟大白菜新品種豫新50 的選育[J].中國瓜菜，2005（4）：27-29.

[42]姚秋菊，蔣武生，原玉香，等.游離小孢子培養(yǎng)育成早熟大白菜新品種‘豫新 58’[J].園藝學(xué)報(bào)，2008，35（6）：929.

[43]Zhang F L,Takahata Y.Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage (Brassica campestris L.ssp.pekinensis)[J].Breeding Science,1999,49:161-166.

[44]Kuginuki Y,Nakamura K,Hida K I,et al.Varietal differences in embryogenic and regenerative ability in microspore culture of Chinese cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)[J].Breeding Science,1997,47(4):341-346.

[45]Zhang F L,Takahata Y.Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops[J].Theor Appl Genet,2001,103:254-258.

[46]Zhang F L,Aoki S,Takahata Y.RAPD markers linked to microspore embryogenic ability in Brassica crops[J].Euphytica,2003,131:207-213.