小RNA病毒基因組3′非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展*

婁 慧,呂建亮,張永光

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室甘肅蘭州730046)

小RNA病毒基因組由單一正鏈RNA組成,大小約7.0 kb～8.5 kb,其中非編碼區(qū)包括5′端和3′端,基因組5′UT R長600 nt～1 300 nt,連接有一個(gè)病毒小蛋白VPg,內(nèi)含病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),5′UT R結(jié)構(gòu)與功能已得到廣泛研究,但3′UT R的研究還較少。3′UT R長約為50 nt～100 nt,最長約為366個(gè)核苷酸(鴨肝炎病毒)[1],后面緊接著一個(gè)poly(A)尾巴,該結(jié)構(gòu)與病毒RNA復(fù)制和翻譯有關(guān)[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3′UT R內(nèi)有許多保守的莖環(huán)和假結(jié)結(jié)構(gòu),并且這些保守的高級結(jié)構(gòu)對病毒基因組或亞基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯有重要的調(diào)控功能[3]。因此,研究小RNA病毒3′UTR結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、各種調(diào)控元件的作用機(jī)理及多種蛋白質(zhì)因子結(jié)合等問題,有助于更深入了解小RNA病毒復(fù)雜的生命機(jī)制,并為小RNA病毒病的治療和疫情預(yù)報(bào)提供寶貴的參考資料。

1 3′UTR高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

小RNA病毒3′UT R是一個(gè)高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu),是病毒基因組復(fù)制的主要調(diào)控位點(diǎn),其核心結(jié)構(gòu)由莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure)組成,莖環(huán)結(jié)構(gòu)是RNA分子內(nèi)部反向互補(bǔ)的序列,通過堿基互補(bǔ)配對形成的二級結(jié)構(gòu)。當(dāng)反向互補(bǔ)序列間距較大時(shí),形成的未配對單鏈稱為環(huán)(1oop),配對雙鏈稱為莖(stem)[4]。如腸道病毒的X結(jié)構(gòu)域由8對堿基組成,Y結(jié)構(gòu)域由12對堿基組成,X結(jié)構(gòu)域相對于Y結(jié)構(gòu)域的重要作用,是由于它們中任何一個(gè)突變是通過另外一個(gè)突變來抑制的。說明了這兩個(gè)區(qū)域是相互關(guān)聯(lián)的,即兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中某一區(qū)域相互扭曲,從某種程度上來說其中一個(gè)空間位點(diǎn)的改變需要另一個(gè)空間位點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的變化。X結(jié)構(gòu)域或Y結(jié)構(gòu)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)堿基的局部旋轉(zhuǎn)的表型效應(yīng),說明了在這些區(qū)域內(nèi)這兩個(gè)主要的末端堿基充當(dāng)了定位識別信號[5]。GC堿基對占據(jù)了末端位置,螺旋的長度由12個(gè)堿基組成,其中8個(gè)堿基來自于X結(jié)構(gòu)域。此外,連接同軸Y-X和K-Y連接體的單鏈區(qū)是單環(huán)位置的重要決定因素,改變連接體的長度將導(dǎo)致RNA復(fù)制缺損。改變高度保守的Y-X間隔區(qū)的序列的突變將導(dǎo)致病毒出現(xiàn)異常表型,這可能是由于降低了病毒識別特異性配體的能力[6]。Raviprakash K等[7]分析了丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)3′UTR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),認(rèn)為該科病毒自3′端90個(gè)～100個(gè)核苷酸能夠形成多個(gè)熱力學(xué)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu),且這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)高度保守。Peter F等[8]在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh-7中,應(yīng)用HCV RNA亞基因組自復(fù)制系統(tǒng)(self-replication of subgenomic HCV RNA)對HCV 3′UTR功能進(jìn)行了研究,認(rèn)為刪除X區(qū)(自3′端的98 nt)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)后,病毒喪失復(fù)制能力。

此外,在3′UTR內(nèi)還存在著由二級結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)上的單鏈堿基與環(huán)外堿基形成的“吻”形的假結(jié)(pseudoknot structure)。Pilipenko E V等[9]首先發(fā)現(xiàn)了存在于腸道病毒X和Y莖環(huán)之間的這種結(jié)構(gòu),由X區(qū)環(huán)結(jié)構(gòu)和Y區(qū)與其互補(bǔ)的環(huán)結(jié)構(gòu)組成,并將其命名為K結(jié)構(gòu)域。假結(jié)可能是核糖體及內(nèi)部翻譯起始相關(guān)因子的有效結(jié)合部位,并且能加強(qiáng)核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的活性[10-11],因此3′UTR中的假結(jié)是小RNA病毒翻譯的重要調(diào)控元件。但是假結(jié)的穩(wěn)定性不高,常以變換折疊的結(jié)構(gòu)存在。Pilipenko E等[12]還發(fā)現(xiàn)K結(jié)構(gòu)域的不穩(wěn)定性嚴(yán)重抑制PV病毒RNA合成,如果這種不穩(wěn)定性能夠恢復(fù),突變病毒連續(xù)傳代后毒力便得以恢復(fù),這說明了K結(jié)構(gòu)域在PV 3′UT R中的重要性。Melchers等通過反向遺傳對柯薩奇病毒B3(CVB3)的3′UT R進(jìn)行了分析,認(rèn)為K結(jié)構(gòu)域在3′UTR調(diào)節(jié)病毒復(fù)制過程中起著至關(guān)重要的作用。所有腸道病毒的K結(jié)構(gòu)域都由6個(gè)堿基對組成,K結(jié)構(gòu)域內(nèi)個(gè)別堿基錯(cuò)配造成的扭曲,能夠?qū)е虏《緦崦舾猩踔了劳?如果K結(jié)構(gòu)域中一條鏈被它的互補(bǔ)相似物所取代,病毒復(fù)制將被阻斷。另一方面,K結(jié)構(gòu)域中全序列反復(fù)交換將最終導(dǎo)致該病毒出現(xiàn)野生型特性。這就說明,二級結(jié)構(gòu)對負(fù)鏈RNA的起始要比堿基組成對與負(fù)鏈RNA的起始更為重要[13]。Melchers W J等[14]利用計(jì)算機(jī)對人腸道病毒B型(HEV-B)3′UTR二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,從模型中可以看出,K結(jié)構(gòu)域疊加在X結(jié)構(gòu)域之上,形成一個(gè)單股超螺旋,這個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu)域通過5個(gè)核苷酸組成的單鏈區(qū)與Y結(jié)構(gòu)域連接在一起,形成穩(wěn)定變體。參與K結(jié)構(gòu)域形成的X區(qū)環(huán)這部分通過單個(gè)核苷酸橋與X區(qū)莖連接在一起,如果這個(gè)核苷酸連接了K結(jié)構(gòu)域的凹槽,則對病毒的復(fù)制無任何影響。

2 3′UTR缺失型突變體和嵌合體病毒

小RNA病毒特異性的3′UTR能夠促使RNP(核糖核酸聚合酶)起始物的有效合成,RNP起始物為負(fù)鏈RNA合成所必需,然而T odd S等[15]報(bào)道稱,缺失3′UT R的PV依然有活力,但生長較為緩慢。缺失3′UT R的柯薩奇病毒B4(CVB4)也能夠以低生長特性存活[16],對整個(gè)CVB基因組序列分析表明,3′UTR存在與否不影響病毒的存活。然而,Brown D M等[17]隨后發(fā)現(xiàn)其他缺失3′UTR的病毒沒有生長活力。腸道病毒3′UTR有著保守的結(jié)構(gòu),這個(gè)保守的結(jié)構(gòu)是由X和Y環(huán)組成的K結(jié)構(gòu)域與螺旋區(qū)連接在一起構(gòu)成的,普遍認(rèn)為K結(jié)構(gòu)域的扭曲能夠?qū)е虏《净盍适?但是如果K結(jié)構(gòu)域的扭曲恢復(fù)或全部刪除X和Y結(jié)構(gòu)域,病毒便可恢復(fù)活力。通過對缺失3′poly(A)尾巴的CVB突變體試驗(yàn)分析得知,3′端poly(A)尾巴是富含腺嘌呤的序列,是CVB病毒復(fù)制的必要條件。

在缺失3′UTR的腸道病毒中,RNA復(fù)制減弱的原因目前還不清楚,感染細(xì)胞過程中,復(fù)制復(fù)合體的形成存在這樣一種解釋,即病毒的復(fù)制發(fā)生在膜結(jié)構(gòu)上,新翻譯的病毒蛋白與模板RNA分子在膜結(jié)構(gòu)上緊密結(jié)合,由于病毒蛋白在這種微環(huán)境下相對集中,所以在缺失3′UTR的情況下,負(fù)鏈RNA的起始仍然能以低水平進(jìn)行,然而沒有缺失3′UT R的突變體獨(dú)立存在,RNP復(fù)合物對負(fù)鏈RNA合成的最適條件及完整的3′UT R的存在是病毒存活的前提。然而,功能相似的3′UT R在其他的小RNA病毒中也許有完全不同的結(jié)構(gòu)機(jī)制[18]。因此,小RNA病毒復(fù)制機(jī)制要與負(fù)責(zé)病毒RNA起始的不同組織蛋白因子相一致。小RNA病毒3′UT R的這種特性在密切相關(guān)的腸道病毒屬和鼻病毒屬中得到了證實(shí),腸道病毒屬和鼻病毒屬3′UTR結(jié)構(gòu)不同,但在功能上可互換。用柯薩奇病毒B4(CVB4)或人鼻病毒14(HRV14)的3′UT R置換3型PV的3′UT R,使PV病毒具有野生型病毒的復(fù)制活力,牛腸道病毒或甲型肝炎病毒3′UTR與3型PV 3′UTR置換,RNA的復(fù)制也是同樣如此,雖然復(fù)制水平要比在CVB4和HRV14中低,但與缺失3′UT R的PV復(fù)制相似[19]。因此,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的小RNA病毒間3′UT R的交換表明,RNA復(fù)制通過與RNA合成相關(guān)的病毒蛋白及病毒RNA其他元件的相互協(xié)同作用來進(jìn)化[20]。

3 3′UTR與蛋白質(zhì)因子間復(fù)雜的相互作用

小RNA病毒的3′UTR含有復(fù)制起始識別位點(diǎn)以及多種調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn),3′UTR中的高級結(jié)構(gòu)與病毒或宿主蛋白因子相互作用,從而參與調(diào)節(jié)病毒的翻譯和復(fù)制。Zoll J等研究表明,腸道病毒的RNA是由病毒5′UT R和3′UTR,以及細(xì)胞和病毒蛋白組成的生物大分子復(fù)合物合成。3′UT R是RdRp(依賴RNA的RNA聚合酶)的第一結(jié)合位點(diǎn),為了充當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn),RdRp與3′UT R的相互作用就要有一定的特異[21]。Meredith J M[22]通過將人鼻病毒14(HRV14)的3′UT R替換PV的3′UTR的試驗(yàn),證實(shí)了這種特異性。Cui T等[23]研究發(fā)現(xiàn),N18Y突變株被檢測到具有RdRp的活性缺口,這就說明了聚合酶與3′UTR之間可以直接相互作用,3′UT R與聚合酶的相互作用的這種特性在其他小RNA病毒,如EMCV和甲型肝炎病毒(HAV)中也得到了證實(shí),但是RdRp結(jié)合到3′UTR的這種特性仍有待于進(jìn)一步的研究。此外,多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白(ploypyrimidine tractbinding protein,PTB)也是一類重要的蛋白質(zhì)因子,可與HCV 3′UTR X結(jié)構(gòu)域中保守的莖環(huán)-2和莖環(huán)-3作用[24]。Ali N等[25]研究發(fā)現(xiàn)PTB也可以與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)5′和3′端結(jié)合,可以穩(wěn)定IRES的三級結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)是其他因子結(jié)合的前提條件,另一方面,PTB本身也可能帶有其他因子的結(jié)合位點(diǎn)[26-27],與PTB結(jié)合位點(diǎn)的突變可影響起始復(fù)合物的形成和翻譯。因此,與PTB結(jié)合的X結(jié)構(gòu)域的序列和結(jié)構(gòu),對提高病毒蛋白翻譯效率具有重要意義。

RNP復(fù)合物參與負(fù)鏈RNA的形成已得到了廣泛的研究,Dmitrieva T M等[28]對宿主蛋白參與小RNA病毒復(fù)制已做出了假設(shè),但宿主細(xì)胞因子與3′UTR形成活性RNP中的作用目前還不十分清楚。Harris K S等[29]認(rèn)為3CD和3AB與3′UTR的結(jié)合,不依賴宿主蛋白因子的相互作用,并能夠在體外進(jìn)行RNA復(fù)制。Mellits K H等[30-31]研究發(fā)現(xiàn)了核蛋白因子能夠與PV、柯薩奇病毒及鼻病毒的3′UTR結(jié)合。McBride A E等[32]證實(shí)了Sam68蛋白是一種RNA的結(jié)合蛋白,在感染細(xì)胞中與PV的RdRp結(jié)合,但是Sam68蛋白在RNA復(fù)制中的作用目前還不清楚。宿主蛋白因子與3′UTR相互作用的重要性,通過突變實(shí)驗(yàn)得以證實(shí),經(jīng)過特異性突變,使宿主蛋白與RNA的親和力降低,從而影響了PV RNA復(fù)制的效率。宿主蛋白因子被認(rèn)為是核仁蛋白,這種核因子能夠在PV感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中聚集,3′UTR突變分析表明,完整的3′UTR能有效結(jié)合核仁蛋白,PV RNA復(fù)制過程中核仁蛋白的重要作用,已被無細(xì)胞提取物試驗(yàn)證實(shí)。Waggoner S等[33]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從體外PV合成提取物中抽去核仁蛋白,病毒的增殖和感染性病毒粒子的數(shù)量都將減少。

4 Poly(A)尾巴

所有小RNA病毒3′UT R都有一個(gè)Poly(A)的尾巴,病毒RNA的翻譯和復(fù)制都依賴Poly(A)尾巴的存在,小RNA病毒在復(fù)制過程中以負(fù)鏈Poly(U)為模板,合成正鏈的Poly(A)尾巴[34]。Poly(A)尾巴長度與病毒的感染性有關(guān),不同血清型的FMDV的感染性與Poly(A)長度不一樣,對于A型FMDV的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Poly(A)序列少于l0個(gè)堿基時(shí),病毒的感染性與具有大約40個(gè)Poly(A)的FMDV的感染性相同,但為了保證病毒的感染性,要求Poly(A)序列存在一個(gè)最小的長度。Barry等研究認(rèn)為O型FMDV Poly(A)的長度與病毒感染性之間的關(guān)系很小或沒有;而C型Poly(A)序列10個(gè)堿基與40個(gè)堿基之間的感染性差異介于5倍～16倍之間,與PV、EMCV等病毒相似[35]。Potor等分析了5種血清型FMDV Poly(A)的側(cè)翼序列,發(fā)現(xiàn)Poly(A)序列上游的20堿基有75%的同源性,A10和O1 K的3′UTR的同源性為92%。Gutierrez A等[36]研究認(rèn)為,FMDV 3′末端基序的高度扭曲,是負(fù)鏈RNA的合成的必要條件,因此可以認(rèn)為起始負(fù)鏈RNA合成時(shí),與病毒聚合酶結(jié)合的基因存在于這個(gè)區(qū)域。Grubman M J認(rèn)為Poly(A)尾巴具有起始RNA合成以及阻止細(xì)胞核酶對mRNA的降解的作用。

5 展望

小RNA病毒非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能已得到廣泛的研究,但對于3′UT R的研究還較少。3′UT R可能與病毒抗原演化和病毒感染動(dòng)物的嗜性有關(guān),而內(nèi)部的基序則成為起始復(fù)合物形成或維持空間構(gòu)象的某些蛋白因子的結(jié)合平臺,因此研究小RNA病毒3′UTR結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,可為確定復(fù)制與表達(dá)位點(diǎn)等研究奠定理論基礎(chǔ),同時(shí)為今后建立新型疫苗提供了思路和方向。

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