大腸埃希菌耐藥譜型、基因型和生物膜表型關(guān)系研究*

陳朝喜,朱恒乾,廖曉萍,劉雅紅*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)教研室,廣東廣州510642;2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)教研室,四川成都610041)

在抗生素壓力下,大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)能夠形成生物被膜得以生存,導(dǎo)致對(duì)臨床抗菌藥物的敏感性降低[1]。同時(shí)生物被膜作為大腸埃希菌的毒力因子之一,常常引起持續(xù)性感染的遷延不愈[2-5]。因此,從研究耐藥譜型、基因型和生物被膜表型之間相互關(guān)系的角度探究生物被膜的耐藥機(jī)制,闡述抗菌藥物和生物被膜形成之間的相互作用,探討在不同抗生素壓力下生物被膜形成能力的變化,對(duì)大腸埃希菌流行病學(xué)研究和大腸埃希菌生物被膜感染疾病的防治藥物篩選具有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大腸埃希菌樣本來(lái)源 249株大腸埃希菌采自廣東省養(yǎng)殖場(chǎng)(禽類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)豬場(chǎng),包括養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)耐寥篮退翗颖?和寵物醫(yī)院,大部分的樣本從患病動(dòng)物的糞便、腸道內(nèi)容物和臟器分離。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理教研室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,MH肉湯,蛋白胨大豆肉湯等為廣州環(huán)凱生物科技有限公司產(chǎn)品;分子生物學(xué)試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;ERIC-PCR通用引物由上海英駿生物工程有限公司合成(ER-F:5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′;ER-R:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)。

1.1.3 抗菌藥物 恩諾沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林、利福平、氨芐西林、安普霉素、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻呋、鏈霉素、新霉素和卡那霉素由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)藥廠惠贈(zèng),臨用前配成5 120 μ g/mL備用。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判定按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法操作程序進(jìn)行[6]。

1.2.2 249株臨床分離大腸埃希菌生物被膜表型分析 參照Peeters和Stepanovic等的微孔板法進(jìn)行[7-8],具體方法如下:在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的加入200 μ L經(jīng)1∶100稀釋的菌液,陰性對(duì)照孔只加入相應(yīng)量的TSB肉湯,37℃培養(yǎng)24 h,然后棄去每孔內(nèi)培養(yǎng)液并用250 μ L滅菌PBS溶液漂洗3次以徹底棄去孔內(nèi)未黏附的浮游菌,孔壁上黏附的細(xì)菌用200 μ L 990 mL/L甲醇固定15 min后,棄去甲醇,室溫下自然風(fēng)干。200 μ L 20 g/L結(jié)晶紫染色5 min,然后將96孔微量培養(yǎng)板浸沒(méi)在流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗干凈多余的染料。待微孔板過(guò)夜自然風(fēng)干后,結(jié)合在孔內(nèi)的染料用160 μ L 330 g/L冰乙酸溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD570值。每個(gè)細(xì)菌接種4孔,每個(gè)菌3次重復(fù)。根據(jù)測(cè)試孔與陰性對(duì)照孔OD570比值的不同,將所分離大腸埃希菌的生物被膜表型分為4個(gè)表型,即無(wú)成膜能力(—),弱成膜能力(+),中等成膜能力(++)和強(qiáng)成膜能力(+++)。

1.2.3 249株臨床分離大腸埃希菌耐藥性分析及其與生物被膜表型的關(guān)系 采用Whonet5.4軟件對(duì)臨床分離的249株大腸埃希菌的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,按照耐藥譜型的不同進(jìn)行分析匯總。結(jié)合1.2.2結(jié)果分析耐藥譜型與生物被膜表型之間關(guān)系。

1.2.4 大腸埃希菌生物被膜表型和基因型的關(guān)系

1.2.4.1 大腸埃希菌基因組DNA提取采用陶文琴等方法進(jìn)行基因組DNA的抽提[9]。

1.2.4.2 ERIC-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 采用腸桿菌科基因間重復(fù)一致序列引物進(jìn)行擴(kuò)增[10-11],ERIC-PCR的25 μ L PCR反應(yīng)體系包括兩條引物(50 pmol)各1 μ L、DNA溶液2 μ L、dNTP混合物2 μ L、Ex Taq(5 U/μ L)0.25 μ L及2.5 μ L緩沖液,各組分加入后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至25 μ L后充分混勻,按照下面的反應(yīng)條件進(jìn)行:94℃預(yù)變性5 min,然后接著35個(gè)循環(huán),循環(huán)條件為:94℃1 min,53℃1 min,72℃4 min,最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

1.2.4.3 ERIC-PCR指紋圖譜聚類(lèi)分析 采用NTSYS pc 2.1軟件對(duì)ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行分析,得到Jaccard's遺傳相似性系數(shù)矩陣,采用非加權(quán)配對(duì)法做遺傳分析,繪制聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖譜。

2 結(jié)果

2.1 249株大腸埃希菌耐藥譜分布規(guī)律與成膜能力表型分析

249株不同成膜能力表型的大腸埃希菌的耐藥譜型分析匯總結(jié)果顯示,除了強(qiáng)成膜能力表型組的耐藥譜型比較分散外,其余3種表型的耐藥譜型主要集中在5～10耐之間(圖1)。強(qiáng)成膜能力組的耐藥譜型主要分布在4耐和7耐,分別占強(qiáng)成膜能力表型組的25.0%和37.5%。中等成膜能力組的耐藥譜型主要集中在7～10耐,占65.96%,其中7～10各耐藥譜分別占該表型的17.02%、19.15%、12.77%、17.02%。弱表型能力組的耐藥譜型在5～10耐的比例相差不大,集中了該耐藥譜型的81.39%,而5～10耐藥譜型分別占弱表型能力組的13.95%、13.18%、12.40%、13.18%、14.73%、13.95%。無(wú)成膜能力組的耐藥表型也主要分布在5～10耐之間,占84.62%,除了9耐和10耐占的比例比較大(分別為21.54%和23.08%)外,其余幾個(gè)耐表型菌低于15.0%。

圖1 249株不同成膜能力大腸埃希菌耐藥譜分布規(guī)律Fig.1 Drug-resistance spectrum of 249 E.coli strains in different biofilm-forming ability

2.2 大腸埃希菌臨床分離株ERIC-PCR指紋圖譜的聚類(lèi)分析

64株臨床分離大腸埃希菌PCR產(chǎn)物15 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖2),利用UVI Photo MW軟件包對(duì)ERIC-PCR的電泳圖譜進(jìn)行處理,圖譜中每一條帶(DNA片段)均作為一個(gè)分子標(biāo)記,并代表一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),根據(jù)各條帶對(duì)應(yīng)的峰圖進(jìn)行相關(guān)參數(shù)(峰體積,峰高度和峰面積)的比較。然后根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移速率,將同一水平線上,即同一分子質(zhì)量大小,有帶的樣品讀為“1”,無(wú)帶或者條帶模糊且很淡的樣品讀為“0”。所得的位點(diǎn)按分子質(zhì)量從大到小排列。讀出并記錄3條以上不同的帶,將讀出來(lái)的帶(用0和1來(lái)表示)轉(zhuǎn)換成Excel表格文件,制成0～1表之后,轉(zhuǎn)換為純文本文件用于數(shù)據(jù)處理。

圖2 ERIC-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ERIC-PCR products

應(yīng)用NTSYS pc2.1軟件對(duì)64株臨床分離大腸埃希菌ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行分析,得到大腸埃希菌指紋圖譜的Jaccard's遺傳相似性系數(shù)矩陣,結(jié)果以非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)配對(duì)進(jìn)行聚類(lèi)分析,自動(dòng)生成相似系數(shù)和樹(shù)狀圖。

64株大腸埃希菌的聚類(lèi)分析分為A,B,C和D 4個(gè)型,從表1可以看出,不同成膜能力在各個(gè)型中均有分布,而中等成膜能力組主要分布在A和C型,成膜能力弱的組主要分布在B、C和D,無(wú)成膜能力組的菌株則主要分布在D型。ERIC-PCR基因分型技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)從表型和基因水平探究大腸埃希菌菌株生物被膜的形成機(jī)理,并提供可靠的理論依據(jù),對(duì)大腸埃希菌的流行病學(xué)研究和生物被膜感染防治藥物的篩選具有一定的實(shí)際意義。

表1 臨床分離株大腸埃希菌生物被膜表型和ERIC-PCR基因分型關(guān)系Table 1 Relationship between E.coli biofilm phenotype and ERIC-PCR genotype

3 討論

3.1 耐藥譜型與生物被膜表型的關(guān)系

分析耐藥譜型和生物被膜表型之間的關(guān)系,有助于闡述在形成生物被膜的過(guò)程中,抗菌藥物和生物被膜形成能力之間相互作用,為進(jìn)一步探討生物被膜形成對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明,在臨床分離的249株大腸埃希菌中,不同成膜能力表型的大腸埃希菌對(duì)實(shí)驗(yàn)中常用抗菌藥物的耐藥譜型主要集中在5～10耐之間,耐藥譜型的多樣性是造成生物被膜能力差異的主要原因,且在耐藥譜型中耐藥抗菌藥物種類(lèi)過(guò)多和過(guò)少對(duì)生物被膜的表型能力的影響不顯著。

3.2 ERIC-PCR基因指紋圖譜分析與成膜能力表型關(guān)系研究

本研究通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)64株臨床分離的大腸埃希菌進(jìn)行ERIC-PCR分析并建立基因指紋圖譜,對(duì)不同生物被膜表型大腸埃希菌臨床菌株進(jìn)行分型,在表型水平和基因水平證實(shí)大腸埃希菌生物被膜表型與其基因型關(guān)系密切:64株大腸埃希菌臨床菌株分為A、B、C、D 4個(gè)基因型且生物被膜形成能力較中等和弱的菌株大都屬于B型和C型,而不能形成被膜的菌株大都屬于D型,與Casarez和Wei等的研究結(jié)果相近。

3.3 ERIC-PCR分型技術(shù)探討

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道利用ERIC-PCR對(duì)腸桿菌科進(jìn)行分型研究,擴(kuò)增引物的選擇存在兩種模式:即單引物擴(kuò)增[12-13]和雙引物擴(kuò)增[14-15]。Yang W Q等[17]在對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行分型時(shí)采用ERIC-PCR單引物進(jìn)行擴(kuò)增,這可能是隨機(jī)擴(kuò)增的原理,其擴(kuò)增的片段大小分布在100 bp～2 500 bp之間。而我們的研究中采用雙引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增的條帶基本和Yang W Q的報(bào)道一致,擴(kuò)增引物選擇的具體目的和優(yōu)缺點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究和分析。

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