女貞子、淫羊藿補(bǔ)腎中藥對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮舒縮功能的影響

王雪冰 張 磊 田 允 蔡 晶 (深圳市平樂骨傷科醫(yī)院，廣東 深圳 518010)

補(bǔ)腎中藥女貞子為木樨科常綠喬木女貞子(Ligustrum lucidum Ait)干燥成熟果實(shí)〔1〕，味甘苦，性涼，歸肝腎經(jīng)，有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥〔2〕。淫羊藿(小檗科箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum，產(chǎn)地四川)的干燥地上部分，為我國傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，歷代本草均有記載。李時(shí)珍在《本草綱目》中稱其有“辛溫，無毒，堅(jiān)筋骨，益精氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”之功效。目前臨床應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了古人論述的范圍，諸多醫(yī)家經(jīng)常將其與其他藥物配伍，治療高血壓。臨床經(jīng)驗(yàn)及諸多醫(yī)家報(bào)道〔3～5〕，降壓西藥結(jié)合以補(bǔ)腎中藥為主藥的中藥復(fù)方治療原發(fā)性高血壓，其療效較單純應(yīng)用降壓西藥為好。我們猜測(cè)補(bǔ)腎中藥女貞子、淫羊藿減輕高血壓患者癥狀的藥理基礎(chǔ)可能和心血管的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)有關(guān)。本課題利用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)模型，探討補(bǔ)腎中藥對(duì)SHR血管內(nèi)皮舒張因子NO、收縮因子ET-1及其相應(yīng)的eNOS、ET-1蛋白和eNOSmRNA、ET-1 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12～14周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔合格證號(hào):NO.SOXK(京)2007-0001〕，雌雄各半，體重(250±10)g;另購?fù)g同種系京都種大鼠(WKY)10只，雌雄各半，體重(238±10)g，實(shí)驗(yàn)前置于福建中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，室溫20℃ ～22℃。大鼠全價(jià)顆粒飼料由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 女貞子(木犀科常綠喬木女貞Ligustrum lucidum Ait.的成熟果實(shí)，產(chǎn)地福建，由福建醫(yī)藥集團(tuán)提供)，淫羊藿(小檗科箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum，產(chǎn)地四川，由福建醫(yī)藥集團(tuán)提供);依那普利(5 mg*16片)為揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)產(chǎn)品，批號(hào):國藥準(zhǔn)字H32026568。NO試劑盒(硝酸還原酶法)由南京建成生物工程研究所提供(批號(hào):20071206)，ET(批號(hào):S10950212)放免試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。eNOS、ET-1抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。引物由Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由Sigma公司合成。引物序列見表1。

表1 各引物序列及PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物制備 女貞子、淫羊藿各38 g，加入500 ml蒸餾水中，浸泡60 min后，煎煮300 ml藥液，過濾后裝瓶密封消毒，4℃冷藏。依那普利25.2 mg，用雙蒸水溶解配成300 ml的水溶液，裝瓶密封消毒，4℃冷藏。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 將40只SHR隨機(jī)分組為女貞子組、淫羊藿組、陽性對(duì)照組、模型組，每組10只(雌雄各半);另外10只(雌雄各半)京都種大鼠(WKY)作為正常對(duì)照組。①女貞子組灌服女貞子水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于成人常用量。②淫羊藿組灌服淫羊藿水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于成人常用量。③陽性對(duì)照組給予依那普利水溶液1.07 mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于成人常用量。④模型組和正常對(duì)照組均灌服同體積的蒸餾水。2次/d灌服，連續(xù)灌胃2 w。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 半自動(dòng)分光光度計(jì)BT-224(意大利生物技術(shù)公司)，Y放射免疫計(jì)數(shù)儀 FJ-2008PS(西安核儀器廠);包埋機(jī)，病理切片機(jī)，倒置光學(xué)顯微鏡數(shù)字圖像分析系統(tǒng)Ⅰmage Pro Plus 6.0。電泳儀 Biometra公司，型號(hào) High vohag power pack p30;核酸蛋白分析儀Amemham biosciences公司型號(hào)Ultrospec 2100pro;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Hettieh公司，型號(hào)Mikro 22R;凝膠成像系統(tǒng)Kodak公司，型號(hào)GL200;梯度PCR儀Biometry公司，型號(hào)96T;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABⅠ公司，型號(hào)7500型。以上儀器均由福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.6 血壓的測(cè)定 給藥前SHR大鼠血壓由動(dòng)物單位提供;給藥結(jié)束后24 h，大鼠麻醉成功，常規(guī)消毒，剪去頸部右側(cè)的毛，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣將筋膜分開，即可見右頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，輕輕分離出右頸總動(dòng)脈一段(2～3 cm)，穿過兩根結(jié)扎線，一根扎住遠(yuǎn)心端，用動(dòng)脈夾夾住近心端，在靠近近心端結(jié)扎線的部位用眼科小剪刀剪一“V”形小口，插入已經(jīng)注滿肝素(40 U/ml)、0.9%生理鹽水的PE-50乙烯管(內(nèi)徑0.5 mm，外徑1 mm)，用近心端的線固定，打開動(dòng)脈夾，血流通暢后壓力信號(hào)經(jīng)A/D卡輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行貯存，打印，輸出，檢測(cè)出大鼠血壓值(收縮壓SBP)。

1.7 血清NO、血漿ET-1的測(cè)定

1.7.1 血液標(biāo)本的采集 給大鼠稱重，腹腔注射氯氨酮(0.3 ml/100 g)麻醉，麻醉成功后，常規(guī)消毒，腹主動(dòng)脈采血。其中1 ml注入無抗凝劑的離心管中，低溫離心(4℃、3 000 r/min、15 min)，收集上清-20℃保存以備同批測(cè)定。取2 ml注入含10%的EDTA二鈉30μl和抑肽酶40μl的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min離心 10 min，分離血漿，收集血漿-20℃保存以備同批測(cè)定。

1.7.2 血清NO與血漿ET的測(cè)定 血清NO用半自動(dòng)分光光度計(jì)采用硝酸還原酶法測(cè)定，以μmol/L為單位。血漿ET-1采用放射免疫分析法檢測(cè)，以pg/ml為單位，操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET-1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取2 cm主動(dòng)脈置于10%甲醛中浸泡固定，包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)橫斷面連續(xù)切片，厚度為4μm，烤片60 min，脫蠟，水化，3%H2O2預(yù)處理，5%BSA室溫封閉20 min，抗eNOS抗體(稀釋度1∶50)和抗ET-1抗體(稀釋度1∶200)分別加入鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶依次反應(yīng)和洗滌后，以DAB染色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以光鏡下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿染成淺黃色、棕黃色或棕褐色為陽性著色。按陽性染色細(xì)胞所占比例分為3級(jí):陽性染色細(xì)胞占15%～35%為弱陽性反應(yīng)(+);陽性染色細(xì)胞占36%～75%為陽性反應(yīng)(?);陽性染色細(xì)胞占75%以上為強(qiáng)陽性反應(yīng)(?);利用顯微攝像系統(tǒng)在400倍下，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Ⅰmage Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析目的蛋白的表達(dá)量，測(cè)定主動(dòng)脈內(nèi)膜eNOS、ET-1蛋白表達(dá)的平均光密度值。

1.9 主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的檢測(cè) 取材后的標(biāo)本凍存于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。按照Ⅰnvitrogen公司的TRⅠZOL總RNA提取試劑盒說明書提取組織總的RNA。采用兩步RT-PCR法進(jìn)行測(cè)定eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用方差分析、兩兩比較的q檢驗(yàn)或連續(xù)校正t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 用藥前后各組大鼠血壓值(收縮壓SBP)的變化 從表2可見:用藥前女貞子組、淫羊藿組、陽性對(duì)照組、模型組四組大鼠的血壓均高于正常組(P＜0.05);用藥后女貞子組、淫羊藿組大鼠的血壓較用藥前略有下降，但與模型組無差異(P＞0.05)，明顯高于正常組(P＜0.05)，用藥后陽性對(duì)照組大鼠的血壓較用藥前顯著降低(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05)。

表2 用藥前后各組大鼠血壓值的比較(±s，mmHg)

表2 用藥前后各組大鼠血壓值的比較(±s，mmHg)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與用藥前比較:3)P＜0.05

組別 n 給藥前 給藥后女貞子組 10 184.8±15.91) 179.3±10.41)淫羊藿組 10 186.5±17.81) 172.4±9.91)陽性對(duì)照組 10 181.2±8.91) 141.8±14.52)3)模型組 10 186.3±14.21) 185.8±7.01)正常組10 136.6±22.6 135.5±16.1

2.2 各組大鼠用藥后血清NO、ET比較結(jié)果 如表3，與正常組比較，模型組大鼠NO含量明顯降低(P＜0.05)，ET-1含量顯著升高(P＜0.05);女貞子組、淫羊藿組、陽性對(duì)照組NO含量與模型組比較顯著增加(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05);女貞子組、淫羊藿組、陽性對(duì)照組ET-1含量顯著降低(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05)。

表3 給藥后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

表3 給藥后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n NO(μmol/L) ET-1(pg/ml)女貞子組 10 35.51±6.772) 95.40±8.572)淫羊藿組 10 35.15±7.002) 98.98±10.422)陽性對(duì)照組 10 39.00±5.842) 78.06±26.102)模型組 10 16.92±5.841) 136.92±39.381)正常組10 45.10±7.31 76.09±20.30

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白、ET-1蛋白的表達(dá)

模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS很低表達(dá)，ET-1表達(dá)呈強(qiáng)陽性，與正常組比較有顯著差異(P＜0.05);女貞子組、陽性對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，淫羊藿組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)呈弱陽性表達(dá)，三組與模型組比較有差異(P＜0.05);女貞子、淫羊藿組、陽性對(duì)照組的ET-1呈陰性表達(dá)，與模型組有差異(P＜0.05);正常組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而ET-1呈陰性表達(dá)。見表4。

表4 用藥后各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET-1表達(dá)的比較(±s)

表4 用藥后各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET-1表達(dá)的比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n eNOS ET-1女貞子組 10 0.499±0.0442) 0.323±0.0412)淫羊藿組 10 0.488±0.0692) 0.339±0.0792)陽性對(duì)照組 10 0.511±0.0452) 0.316±0.0832)模型組 10 0.394±0.0641) 0.523±0.0751)正常組10 0.553±0.093 0.310±0.089

2.4 各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達(dá)

2.4.1 eNOS、ET-1和GAPDH基因的定性結(jié)果 分別擴(kuò)增eNOS、ET-1和GAPDH三個(gè)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的大小分別約為418 bp，594 bp，502 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小基本相符。

2.4.2 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達(dá) 如表5所示:模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOSmRNA較正常組明顯降低，而ET-1 mRNA表達(dá)增加(P＜0.05);女貞子、淫羊藿組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOSmRNA表達(dá)明顯增加，與模型組比較有差異(P＜0.05)，ET-1 mRNA表達(dá)明顯減少，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與正常組和陽性對(duì)照組無顯著差異。

表5 給藥后各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表達(dá)(±s)

表5 給藥后各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表達(dá)(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n eNOSmRNA ET-1 mRNA女貞子組 10 0.46±0.0052) 0.43±0.0032)淫羊藿組 10 0.49±0.0022) 0.45±0.0032)陽性對(duì)照組 10 0.58±0.0062) 0.24±0.0022)模型組 10 0.28±0.0021) 0.58±0.0051)正常組10 0.49±0.004 0.21±0.004

3 討論

1993年Ross〔6〕提出內(nèi)皮功能障礙概念，逐漸深入認(rèn)識(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的功能作用。細(xì)胞內(nèi)NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成，有三種一氧化氮合成酶(NOS)，其中eNOS(即NOSⅢ或NOS3)主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與動(dòng)靜脈血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)，與心腦血管疾病的關(guān)系較為密切NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，eNOS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞釋放的基礎(chǔ)NO在調(diào)節(jié)血流和血壓方面起到重要作用，可以通過調(diào)節(jié)eNOS蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)NO的生成。VEC不僅僅具有屏障作用，還是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌功能，其通過釋放血管內(nèi)皮依賴性舒張因子和收縮因子調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞以維持血管張力，其中NO是血管內(nèi)皮舒張因子之一;ET是血管內(nèi)皮收縮因子。ET和NO是一對(duì)矛盾統(tǒng)一體二者相互平衡，共同維持血管的張力，維持血管的舒張和收縮功能。血管細(xì)胞內(nèi)分泌功能異常，特別是NO和ET間平衡關(guān)系的破壞，必然導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂，可表現(xiàn)為血壓升高，NO、ET、合成釋放失衡是高血壓病的重要因素。鑒于原發(fā)性高血壓的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制就是血管內(nèi)皮舒縮功能障礙，我們猜測(cè)補(bǔ)腎中藥為主藥的中藥復(fù)方改善高血壓病臨床癥狀的藥理基礎(chǔ)可能與血管內(nèi)皮舒縮功能的調(diào)節(jié)有關(guān)，而自發(fā)性高血壓大鼠是目前公認(rèn)的最接近人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型〔6～8〕。

中醫(yī)認(rèn)為，高血壓的基本病機(jī)性質(zhì)是本虛標(biāo)實(shí)，肝腎陰虛為本，肝陽上亢為標(biāo)，根據(jù)中醫(yī)治病求本的原則，治以滋補(bǔ)肝腎為主，本研究采用補(bǔ)腎中藥女貞子、淫羊藿，探討補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)主動(dòng)脈內(nèi)皮舒縮因子的分泌，改善主動(dòng)脈內(nèi)皮舒縮功能的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用藥前女貞子組、淫羊藿組、陽性對(duì)照組、模型組四組大鼠的血壓均高于正常組;用藥后陽性對(duì)照組大鼠的血壓較用藥前顯著降低，女貞子組、淫羊藿組大鼠的血壓較用藥前均略有下降，但與模型組大鼠血壓無顯著性差異，雖然單味補(bǔ)腎中藥女貞子、淫羊藿?jīng)]有明顯降低血壓，但略有下降的趨勢(shì)與中醫(yī)理論、文獻(xiàn)報(bào)道以及臨床研究所發(fā)現(xiàn)的補(bǔ)腎中藥為主的復(fù)方改善高血壓病臨床癥狀這一結(jié)論是一致的。

本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎中藥女貞子、淫羊藿能增加主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張因子NO及其蛋白和基因的表達(dá)和降低收縮因子ET及其蛋白和基因的表達(dá)，因此單味中藥女貞子、淫羊藿?jīng)]有明顯降低血壓，但略有下降的趨勢(shì)，且能調(diào)節(jié)主動(dòng)脈血管內(nèi)皮舒縮因子，我們推測(cè)補(bǔ)腎中藥為主的中藥復(fù)方改善高血壓患者的臨床癥狀可能與其調(diào)節(jié)主動(dòng)脈內(nèi)皮舒縮因子的分泌，改善主動(dòng)脈內(nèi)皮舒縮功能有關(guān)。

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