針刺對高脂血癥大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮NF-κB表達(dá)的影響

蔡 輝 袁愛紅 (南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002)

NF-κB是受細(xì)胞還原狀態(tài)影響的轉(zhuǎn)錄因子〔1〕，能夠被致動(dòng)脈粥樣硬化食譜和氧化低密度脂蛋白等〔2〕參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的細(xì)胞產(chǎn)物激活。NF-κB系統(tǒng)與氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)節(jié)有著密切且通用的聯(lián)系〔3～5〕。在人類的一些炎性疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 NF-κB 的激活〔6，7〕。研究顯示，NF-κB 參與了再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化的脈管系統(tǒng)增殖紊亂的發(fā)病機(jī)制〔8，9〕，在增厚的纖維變性的內(nèi)膜-中膜和粥樣斑塊里存在高水平活化的NF-κB，而在健康血管中幾乎檢測不到活化的NF-κB〔10〕。本文在前人研究的基礎(chǔ)之上探討針刺是否能對高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮NF-κB的表達(dá)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 剛斷乳的SD雄性大鼠26只，體重54～69 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號 SYXK(蘇)2003-0032〕。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有SD大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，根據(jù)體重隨機(jī)分為自配方高脂飼料組(17只)和普通飼料組(對照組，9只)，喂養(yǎng)12 w后，空腹過夜，球后靜脈取血3 ml，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，分離血清置-20℃冰箱保存，測NO和髓過氧化物酶(MPO)。然后根據(jù)體重將高脂飼料組大鼠隨機(jī)分為模型組(8只)和針刺組(9只)，針刺組選取后三里、內(nèi)庭、心俞三穴，進(jìn)針后，每穴快速行針1 min，后三里和內(nèi)庭接通G6805Ⅱ型電針儀連續(xù)波15 min，強(qiáng)度1 mA，頻率10 Hz。每次選取一側(cè)肢體，兩側(cè)輪流，周一到周六治療，周日休息，連續(xù)4 w。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均自由攝食飲水。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，用20%氯胺酮，以1 ml/100 g劑量麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟，于冰盤中分離主動(dòng)脈，剪一段2 cm長主動(dòng)脈置4%甲醛固定液中固定，其余置液氮中保存待測各項(xiàng)指標(biāo)。甘油三酯(TG)用TPOPAP法，總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法，NO用硝酸還原法，SOD活力用黃嘌呤氧化酶法，MDA用硫代巴比妥酸法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;NF-κB采用免疫組化法，以平均光密度表示，試劑盒由南京凱基生物公司提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料組間比較用單因素方差分析，方差齊性用LSD，方差不齊用Games-Howell。統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS15.0，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 針刺干預(yù)前高脂組與對照組血清指標(biāo) 高脂組大鼠TG、TC、HDL 和 LDL 明顯高于對照組(P=0.000、0.000、0.001、0.037)。高脂大鼠MPO明顯高于對照組，NO明顯低于對照組(P=0.002，0.000)。見表 1。

表1 針刺干預(yù)前各組血清指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

表1 針刺干預(yù)前各組血清指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) NO(μmol/L) MPO(U/L)對照組(n=9) 0.929 0±0.049 9 1.830 7±0.075 4 1.061 4±0.056 1 0.195 3±0.017 0 23.076 9±1.138 74 2.281 2±2.549 4高脂組(n=17) 1.824 6±0.086 41)3.385 3±0.226 72)1.724 8±0.159 52) 0.407 7±0.092 6 13.074 9±0.762 3 52.229 8±1.563 6

2.2 針刺干預(yù)后各組主動(dòng)脈氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 模型組NO明顯低于對照組(P=0.009)，針刺組NO較模型組明顯升高(P=0.002);模型組SOD明顯低于對照組(P=0.012)，針刺組比模型組明顯升高(P=0.015);模型組MDA明顯高于對照組(P=0.002)，針刺組MDA明顯降低(P=0.004)。見表2。

表2 干預(yù)后各組主動(dòng)脈NO、SOD和MDA檢測結(jié)果(±s)

表2 干預(yù)后各組主動(dòng)脈NO、SOD和MDA檢測結(jié)果(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n NO(μmol/gprot) SOD(U/ml) MDA(nmol/mgprot)對照組 6 16.471 4±1.415 54)396.780 0±34.968 93)1.968 3±0.306 04)模型組 5 9.364 7±1.151 62)241.908 0±18.324 31)3.970 0±0.232 62)針刺組 6 17.310 0±0.957 64)375.870 0±31.038 53)2.328 3±0.260 34)

2.3 各組主動(dòng)脈內(nèi)皮NF-κB的表達(dá) 模型組平均光密度明顯高于對照組(0.505 8±0.083 2，0.215 0±0.021 1，P=0.02)，針刺組明顯低于模型組(0.312 0±0.019 3，P=0.012)，高于對照組(P=0.000)。

3 討論

高脂飲食能夠使機(jī)體的氧化應(yīng)激水平增加〔11〕。本研究結(jié)果顯示，與普通飼料喂養(yǎng)的大鼠相比，高脂飲食喂養(yǎng)的SD大鼠，血清TG、TC、MPO和主動(dòng)脈MDA均明顯升高，血清和主動(dòng)脈NO及主動(dòng)脈SOD均明顯降低，說明高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)生高脂血癥，造成機(jī)體氧化應(yīng)激水平的增加，損傷了主動(dòng)脈內(nèi)皮。血管內(nèi)皮損傷與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

NF-κB是由Rel家族組成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子群，包括5個(gè)緊密聯(lián)系的 DNA 結(jié)合蛋白:RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)，享有一個(gè)高度保守的300個(gè)氨基酸長度的N端Rel同源區(qū)(RHD)，RHD是進(jìn)行DNA結(jié)合、二聚化和核轉(zhuǎn)移的功能區(qū)域。NF-κB快速而短暫的激活對生理功能的實(shí)現(xiàn)具有重要意義，但是各種刺激誘導(dǎo)NF-κB持久活化則會(huì)造成內(nèi)環(huán)境的惡化。研究顯示，NF-κB與氧化應(yīng)激的反應(yīng)過程密切相關(guān)，研究顯示在培養(yǎng)液中直接加入H2O2激活了不同品系細(xì)胞株的 NF-κB〔12〕。

本研究中模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)，分析其原因可能與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。其機(jī)制可能為:一方面高脂時(shí)機(jī)體嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)增加了活性氧(ROS)的釋放，Deng等研究認(rèn)為各種因素引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加都能夠激活NF-κB〔13〕。ROS和氧化應(yīng)激激活了NEMO核輸出級聯(lián)，促進(jìn)了ⅠKK復(fù)合物和NF-κB信號的活化〔14〕，并且該激活依賴于組織的種類和 ROS的濃度〔4〕;激活的 NF-κB抑制了JNK信號，造成了ROS進(jìn)一步的增加〔5〕。另一方面，高脂飲食產(chǎn)生的氧自由基可能引起了主動(dòng)脈的炎癥反應(yīng)。當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)形成時(shí)，NF-κB活性上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞因子、化學(xué)因子、細(xì)胞內(nèi)黏附分子以及激活免疫與炎癥系統(tǒng)的炎性酶的表達(dá)。NF-κB信號通過化學(xué)因子、細(xì)胞因子以及他們各自的受體誘導(dǎo)的自分泌環(huán)結(jié)構(gòu)上的激活發(fā)送，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，這些細(xì)胞密切參與了炎癥過程。研究顯示，ROS能夠誘導(dǎo)DNA損傷和改變細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中最重要的是通過NF-κB的信號。

與模型組相比，針刺組大鼠主動(dòng)脈NO、SOD明顯升高，MDA和NF-κB的表達(dá)顯著降低，說明針刺能夠增強(qiáng)高脂大鼠的抗氧化能力，對高脂大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮具有保護(hù)作用，該作用可能是通過對NF-κB信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。推測針刺抑制NF-κB的可能機(jī)制有二:針刺直接抑制了NF-κB基因的表達(dá);或者針刺抑制了ⅠκB激酶系統(tǒng)的活性。至于其具體機(jī)制，在今后的研究中將繼續(xù)摸索。

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