骨髓間充質干細胞移植對腦缺血模型大鼠記憶功能的影響

劉麗萍 那漢榮(吉林大學藥學院，吉林 長春 3002)

骨髓間充質干細胞(MSCs)能自我更新并具有多種分化潛能，近年來的研究發(fā)現(xiàn)間質干細胞可以橫向分化為外胚層起源的神經(jīng)細胞〔1〕，進一步研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs移植到局灶性腦損傷大鼠的腦內(nèi)能存活、遷移，部分細胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，并能在一定程度上促進腦功能恢復〔2，3〕，使其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應用前景更加廣泛。且其具有取材方便、體外培養(yǎng)易擴增、生物學特性穩(wěn)定、免疫原性低及不受倫理道德的限制等優(yōu)點，成為目前組織工程和再生醫(yī)學研究的一個新熱點。本研究擬通過體外培養(yǎng)擴增大鼠 MSCs，并將經(jīng)DAPⅠ標記的MSCs注入缺血性腦損傷模型大鼠，觀察MSCs移植后在腦損傷大鼠腦組織中的遷徙、定居及對模型鼠學習記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(hyclone公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，DAPⅠ(Sigma公司)。5日齡健康Wistar乳鼠(8～10 g)及6周齡大鼠280～350 g由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 見參考文獻〔4〕。

1.3 MSCs的標記 取生長狀態(tài)良好的3代MSCs，注入前1 d進行標記。棄去MSCs培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入DAPⅠ應用液，10 ml/瓶，置培養(yǎng)箱中1 h后棄去 DAPⅠ應用液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況。收集細胞備用。

1.4 動物模型制備 采用線栓法制備Wistar大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)〔5〕。模型大鼠偏癱清醒后，可見右側肢體癱瘓，以前肢為重;表現(xiàn)為提尾時大鼠右前肢屈曲、內(nèi)收，行走時向右側轉圈或傾倒、偏癱、肢體強直等，提示模型已成功建立。

1.5 DAPⅠ標記的MSCs細胞移植入腦組織 將上述DAPⅠ標記的MSCs濃度調整為1.0×104個/ml，經(jīng)頸外動脈注入模型大鼠。于注入后24 h、第5天及第10天迅速斷頭處死大鼠，取損傷的一側大腦，組織包埋于OCT內(nèi)，冰凍切片機切成2μm的切片，貼附于玻片上，室溫干燥10 min，丙酮固定10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 Morris水迷宮實驗 將實驗動物隨機分為正常組、模型組、PBS注入組及MSCs治療組。每組6只。手術過程中MSCs治療組將上述制備的未經(jīng)DAPⅠ標記的MSCs單細胞懸液濃度調整為1.0×104個/ml，經(jīng)頸動脈注入模型大鼠，PBS組經(jīng)相同部位注入PBS。造模后2 w、8 w采用Morris水迷宮進行學習、記憶能力的測定，以大鼠逃避潛伏期代表學習記憶能力，測定方法同文獻〔6〕，逃避潛伏期越短，大鼠學習記憶能力越強。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。用±s對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述。

2 結果

2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 通過全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)的第3代MSCs，形態(tài)呈長梭形;可以向成骨細胞及脂肪細胞分化;經(jīng)流式細胞儀檢測CD44呈陽性，但CD34和CD45造血譜系標記則呈陰性。

2.2 MSCs在腦組織內(nèi)的遷徒及定位 DAPⅠ標記的MSCs注入MCAO模型大鼠后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，注入后24 h，在損傷腦組織血管內(nèi)出現(xiàn)熒光標記的MSCs;第5天，損傷組織血管及其周圍組織有標記的MSCs彌散;第10天，損傷組織內(nèi)熒光標記的MSCs廣泛彌散。見圖1。

2.3 Morris水迷宮實驗時間結果 第2、8周時，經(jīng)方差分析各組間大鼠逃避潛伏期有顯著性差異(P＜0.05)。進一步兩兩比較，模型組與PBS注入組無差異，而MSCs組與正常組、模型組之間相比有顯著性差異(P＜0.05)，MSCs組動物空間識別、記憶能力明顯強于正常組和模型組，而且MSCs組第8周與第2周結果也有顯著性差異(P＜0.05)，表明移植MSCs能有效提高缺血缺氧性腦損傷大鼠學習、記憶功能。見表1。

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結果(±s，n=6)

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結果(±s，n=6)

時間 正常組 模型組 PBS注入組 MSCs注入組 F值 P值2 w 22.31±2.96 107.73±9.34 108.62±6.34 53.71±8.78 20.02 ＜0.05 6 w 21.46±2.59 99.94±6.16 100.16±5.74 34.09±5.05 34.31 ＜0.05

3 討論

腦缺血性損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)壞死的神經(jīng)組織不能自然恢復。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞雖然能啟動自發(fā)修復反應，但數(shù)量有限〔7〕。神經(jīng)細胞損傷后的組織修復與功能重建一直是神經(jīng)治療上的難題。瑞典神經(jīng)病學家Picini等〔8〕從胎兒腦中分離神經(jīng)組織細胞，植入帕金森病患者的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一半以上患者的癥狀得到改善，而且療效持續(xù)存在。這充分說明神經(jīng)細胞移植是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效手段。但是胚腦組織取材困難，應用受到倫理學和法律的制約，不可能推廣到臨床。與之相比MSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性弱，易于從骨髓中分離、純化及體外擴增，越來越受到人們的重視。

MSC應用于腦血管疾病治療的必要條件是其在腦內(nèi)的成活并且增殖分化，這是其發(fā)揮治療作用的關鍵。Li等〔9〕將MSCs直接注入MCAO大鼠紋狀體內(nèi)，28 d后觀察到MSCs成活并向缺血區(qū)遷移，說明腦缺血或壞死可作為誘導環(huán)境，或者腦缺血后可產(chǎn)生一種信息物質(很可能為炎性物質)，刺激MSCs擴增，然后遷移至腦缺血區(qū)域，參與修復腦缺血后的神經(jīng)功能缺損。本實驗采用體外培養(yǎng)純化MSCs方法，純化擴增MSCs后，經(jīng)頸動脈注入DAPⅠ熒光標記的MSCs 24 h后MSCs即出現(xiàn)在腦損傷區(qū)域血管內(nèi)，第5天在血管周圍組織內(nèi)開始彌散，第10天在損傷區(qū)域可見廣泛彌散，說明MSC治療缺血性腦損傷時能在腦中成活并向缺血部位遷移，參與血管組織修復。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于學習記憶腦機制研究〔10〕，該迷宮系統(tǒng)被廣泛運用在神經(jīng)生物學領域的基礎和應用研究中，用以檢測大鼠的空間學習記憶能力，相對更為客觀。本實驗采用Morris水迷宮了解MSCs治療對MCAO大鼠學習記憶能力的影響，結果顯示，模型組大鼠學習記憶能力與假手術對照組大鼠相比明顯下降，進一步證實了MCAO大鼠模型制作成功。MSCs移植組大鼠逃避潛伏期縮短，空間學習能力明顯強于未移植組;說明大鼠的學習記憶障礙改善。Zhao等〔11〕將純化的人MSCs移植至腦缺血損傷部位，2～8 w后評價大鼠的感覺和運動功能并進行組織學研究，發(fā)現(xiàn)接受移植的大鼠在肢體平放實驗(limb placement test)中的功能明顯改善。Chopp等〔12〕多次將MSCs應用于腦外傷或腦缺血動物模型，發(fā)現(xiàn)MSCs大約有1%分化為神經(jīng)元，5% ～8%分化為神經(jīng)膠質細胞，并且能明顯促進神經(jīng)功能恢復。Chen等〔13〕認為，MSCs能夠通過血腦屏障，到達腦損傷缺血區(qū)并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，修復缺損的神經(jīng)組織。這些研究均說明，MSCs可在腦內(nèi)成活，并可向受損部位遷移，促進神經(jīng)功能恢復，其機制可能與MSCs合成部分細胞外基質、促進神經(jīng)元恢復有關，但其調控機制尚不十分清楚，有待進一步深入研究。

1 Black ⅠB，Woodbury D.Adult rat and human bone marrow stromal stem cells differentiate into neurons〔J〕.Blood Cel Mol Dis，2001;27:632-6.

2 Ⅰrons H，Lind JG，Wakade CG，et al.Ⅰntracerebral xeno transplantation of GFPmouse bone marrow stromal cells in intact and stroke rat brain:graft surviva and immunologic response〔J〕.Cell Transplant，2004;13:283-94.

3 Mahmood A，Lu D，Chopp M.Marrow stromal cell transplantation after traumatic brain injury promotes cellular proliferation within the brain〔J〕.Neurosurgery，2004;55:1185-93.

4 朱 勇，陳良萬，林若柏，等.SD大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)、表型鑒定及標記〔J〕.吉林大學學報醫(yī)學版，2009;35(2):326-41.

5 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究〔J〕.吉林醫(yī)學，2004;25:16-7.

6 陳羅西，郭玲玲，李 亮.Morris圓形水迷宮的應用及其相關檢測指標分析〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008;10(8):55-6.

7 Phinney DG，Kopen G，Ⅰsaacson RL，et al.Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice:Variations in yield，growth，and differentiation〔J〕.J Cell Biochem，1999;72(8):570-85.

8 Picini P，Brooks DJ，Bjorklund A，et al.Dopamine release from nigral transplants visualized in vivo in a Parkinson patient〔J〕.Nat Neurosci，1999;2:1137-45.

9 LⅠY，Chopp M.Chen J，et al.Ⅰntrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2000;20:1311-9

10 Morris RG，Garrud P，Rawlins JN，et al.Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕.Nature，1982;297(5868):681-3.

11 Zhao LR，Duan WN，Reyes M，et al.Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotype sanda meliorate neurological deficits after grafting into the isehemic brain of rats〔J〕.Exp Neurol，2002;174:11-9.

12 Chopp M，Zhang XH，Li Y，et al.Spinal cord injury in rat:treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport，2000;11(13):3001-5.

13 Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats〔J〕.J Neurol Sci，2001;189(1-2):49-57.