β2-腎上腺素能受體基因多態(tài)性與老年慢性阻塞性肺疾病合并高血壓的相關(guān)性

王 成 楊皚嵐 李 華 畢鴻雁 傅瑋萍 戴路明 陳 芬 譚 芳 符 琴 田陸云

(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，云南 昆明 650032)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)與高血壓(EH)都是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病，環(huán)境和基因因素決定其發(fā)病和最終的表型。目前對COPD和EH基因易感性做了大量研究，在眾多候選基因中，β2-腎上腺素能受體(β2-AR)基因引起了廣泛重視。這個(gè)基因變化與支氣管及血管反應(yīng)都有關(guān)，有可能與COPD合并EH有著重要遺傳相關(guān)性。本研究旨在闡明β2-AR基因多態(tài)性對COPD合并EH的發(fā)病是否有影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 各組受檢者均為無血緣關(guān)系的漢族人。①對照組60例，男50例，女10例，年齡(76.25±5.68)歲，均來自我院2009年3～7月健康體檢者，經(jīng)肺功能等檢查排除了COPD、EH、哮喘、糖尿病及肝腎功能不良者。②COPD合并EH組60例，男47例，女13例，年齡(76.32±6.87)歲，均來自我院2008年9月至2009年7月住院病人，經(jīng)病史、體檢、X線胸片或肺部CT及肺功能等相關(guān)檢查確診的COPD合并EH患者并排除了哮喘、繼發(fā)性高血壓、糖尿病及肝腎功能不良者。診斷符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》及《2005年高血壓治療指南》。③COPD組60例，男49例，女11例，年齡(76.73±7.25)歲，來自我院同期的住院病人，經(jīng)病史、體檢、X線胸片或肺部CT及肺功能等相關(guān)檢查確診的無高血壓的COPD患者并排除了哮喘、糖尿病及肝腎功能不良者。診斷符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取外周血2～3 ml，以2%的EDTA抗凝，采用Promega DNA提取試劑盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì) 引物參照有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)〔1〕，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)方法，分別檢測β2-AR單核苷酸多態(tài)性Arg16Gly和Gln27Glu。擴(kuò)增引物序列如下:Arg16Gly多態(tài)性，Arg16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATA-3'，Gly16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATG-3'，反 義 鏈 5'-CCAATTTAGGAGGATGTAAACTTC-3';Gln27Glu多態(tài)性，GLn27:5'-GGACCACGACGTCACGCAGC-3'，Glu27:5'-GGACCACGACGTCACG CAGG-3';反義鏈:5'-ACAATCCACACCATCAGAAT-3'。以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)總體系為50 μl，其中 DNA 模板 1 μl，dNTP(25 mmol/L)1 μl，Mg 離子(2.5 mmol/L)5μl，TapDNA聚合酶1 U，上下游引物各1μl和10×PCR Buffer 5μl。反應(yīng)條件為;94℃預(yù)變性5 min;94℃變性2 min，16位點(diǎn)55℃退火1 min，27位點(diǎn)52℃退火1 min和72℃延伸1 min共35個(gè)循環(huán);終末72℃延伸10 min。

1.2.3 Beta2-AR基因多態(tài)性的檢測 將AS-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物加入含EB的1%的瓊脂糖凝膠樣品孔內(nèi)，置于電泳槽中100 V電泳50 min，在紫外透射儀下觀察結(jié)果并攝像。根據(jù)各電泳道所顯示的電泳條帶判斷其基因型，如僅出現(xiàn)一條氨基酸電泳條帶則為純合子，出現(xiàn)兩條氨基酸電泳條帶則雜合子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料用±s或用四分位間距表示，組間頻率比較用R×C表χ2檢驗(yàn)，多個(gè)組間計(jì)量資料的比較用單向方差分析及進(jìn)一步的多重比較(LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 β2-AR基因16、27位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測 見圖1和圖2。β2-AR基因16位點(diǎn)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為913 bp，β2-AR基因27位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為420 bp。

2.2 各組一般臨床特點(diǎn)比較 見表1。COPD合并EH組及COPD組肺功能與對照組間差異顯著(P＜0.05)。

表1 各組間的一般臨床特點(diǎn)比較(±s)

表1 各組間的一般臨床特點(diǎn)比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 吸煙支數(shù)(支/年) FEV1% FEV1/FVC%COPD合并EH組 300 71.58±11.361) 57.16±8.901)COPD組 293 71.12±12.151) 56.88±9.131)對照組225 96.08±16.75 78.08±5.42

圖1 β2-AR基因16位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測

圖2 β2-AR基因27位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測

2.3 β2-AR 16、27位點(diǎn)等位基因頻率在不同人群的分布Gly16等位基因在云南漢族人群、中國北方漢族人群〔2〕、中國臺(tái)灣人群〔1〕中的頻率分別為36%、48%、40%，其在這三個(gè)群體中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.079，P＞0.05)。Gly16等位基因在云南漢族人群、歐洲人群、非洲人群中的頻率分別為36%、72%、50%，其在這三個(gè)群體中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.422，P＜0.05)。Glu27等位基因在云南漢族人群、中國北方漢族人群、中國臺(tái)灣人群、歐洲人群、非洲人群中的頻率分別為12%、36%、29%、50%和27%。其在各群體中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.969，35.114，P ＜0.05)。

2.4 各組β2-AR 16、27基因多態(tài)性分布 在云南漢族人群中，16位點(diǎn)ArgArg、ArgGly及GlgGly基因型頻率在對照組分別為40%、48%、12%;在 COPD合并EH組為47%、33%、20%;在COPD組為43%、42%、15%。其在三組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.435，P＞0.05)。16位點(diǎn)突變等位基因頻率在對照組為36%，在 COPD合并 EH組為37%，在 COPD組為36%，其在三組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.029，P＞0.05)。27位點(diǎn)GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型頻率在對照組分別為48%、10%、2%;在COPD合并EH組為53%、5%、2%;在COPD組為50%、8%、2%。其在三組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.590，P＞0.05)。27位點(diǎn)突變等位基因頻率在對照組為12%，在COPD合并EH組為7%，在COPD組為10%，其在三組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.451，P＞0.05)。

2.5 β2-AR基因16、27位點(diǎn)基因型與肺功能的關(guān)系 16位點(diǎn)ArgArg、ArgGly及GlyGLy基因型中FEV1值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(81.50±2.60)%，(68.28±4.43)%及(52.02±9.36)%，F(xiàn)=133.292，P＜0.05〕。進(jìn)一步經(jīng)LSD法比較:ArgArg與Arg-Gly組、ArgArg與GlyGly組、ArgGly與GlyGly組間的FEV1的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。27位點(diǎn) GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型的 FEV1值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(71.70±11.64)%、(70.53±11.74)%及(72.85±2.33)%，F(xiàn)=0.048，P ＞0.05〕。

3 討論

本研究結(jié)果提示不同種族間Beta2-AR基因的SNP分布頻率存在差異，這種差異可能是導(dǎo)致不同種族Beta2-AR分布密度和受體反應(yīng)性差異的原因之一。

目前對COPD和EH的流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制及自然病程仍不是十分清楚，但已經(jīng)明確的是，兩者均是由環(huán)境與遺傳因素共同作用的多基因遺傳疾病。在眾多的候選基因中，因?yàn)棣?-AR基因的變化與支氣管及血管反應(yīng)性都有關(guān)，該基因逐漸引起了廣泛重視。Gly16變異型可增強(qiáng)長期使用β2-AR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體下調(diào)作用，而Glu27對β2-AR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體反應(yīng)性下調(diào)有抵抗作用。Glu27純合子患者比Gln27純合子患者氣道反應(yīng)性低，可能是由于Gln27β2-AR與循環(huán)中兒茶酚胺和外源性激動(dòng)劑結(jié)合能下調(diào)β2-AR數(shù)目，而Glu27無此作用，因此Gln27個(gè)體具有更高的氣道反應(yīng)性，而氣道高反應(yīng)性是COPD患者呼吸道癥狀發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Ho等〔1〕研究提示Gly16等位基因增加COPD的易感性，而Gln27多態(tài)性在COPD組與對照組中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其與COPD的嚴(yán)重程度有關(guān)。曹霞等〔3〕研究表明β2-AR基因Gln27Glu基因多態(tài)性及單倍體可能參與COPD的發(fā)病機(jī)制。Melanie等〔4〕研究顯示Arg16純合子型與呼吸道的氣喘癥狀有關(guān)，并會(huì)增加患COPD的風(fēng)險(xiǎn)，而Gln27純合子型與呼吸道的氣道高反應(yīng)性(BHR)有關(guān)，會(huì)增加患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。提示 Arg16Gln27單倍體型與COPD、BHR和哮喘有密切關(guān)系。Bregger等〔5〕研究 Arg16Arg和Gln7Glu的基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病無關(guān)。而Ranade等〔6〕研究顯示Gly16等位基因與我國人群EH的關(guān)系密切，Gln27Glu基因多態(tài)性與EH的關(guān)系不明顯。朱建等〔7〕研究表明對我國漢族人群而言，Beta2-AR16位點(diǎn)多態(tài)性基因型頻率和正常血壓人群無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而Gln27純合子型在高血壓組明顯高于正常血壓人群，并提示Gln27純合子型患EH的危險(xiǎn)性比對照人群高2倍以上。

本研究提示Gly16等位基因的存在增加肺功能的損害，而27位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺功能無關(guān)。該結(jié)果與Ho等〔1〕的部分研究結(jié)果相同。雖然我們未發(fā)現(xiàn)β2-AR基因27位點(diǎn)基因多態(tài)性對FEV1的顯著性影響，但可能與檢測到的該位點(diǎn)變異例數(shù)較少，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)方法的判別范圍有關(guān)。

本研究的結(jié)論是β2-AR基因16、27位點(diǎn)基因型多態(tài)性的分布在不同族群中存在差異，提示族群對基因突變可能有一定影響。在本研究人群中，β2-AR基因16、27位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD合并EH的易感性可能無相關(guān)性，但16位點(diǎn)的基因多態(tài)性與肺功能可能有關(guān)，在某種程度上影響疾病的嚴(yán)重程度。上述研究結(jié)果與以往研究存在不一致的原因可能是:一是COPD和EH的易感性不但受遺傳因素的影響，還受到其他因素如吸煙、環(huán)境污染、氣候等的影響，在我們的研究人群中，β2-AR基因多態(tài)性的影響可能被其他影響因素降低。二是COPD和EH作為多基因疾病，其具有遺傳異質(zhì)性，COPD和EH患者遺傳背景的不同，可能引起研究結(jié)果的不同。三是從樣本數(shù)量上看，這些研究都只是一些初步工作，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行更深入研究。

1 Ho LⅠ，Harn HJ，Chen CJ，et al.Polymorphism of the beta2-adrenoceptor in COPD in Chinese subjects〔J〕.Chest，2001;120(5):1493-9.

2 高光凱，蔣一平，王士雯.中國北方漢族人群beta2-腎上腺素能受體基因多態(tài)性研究〔J〕.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2002;10(1):18-20.

3 曹 霞，李清泉，陳國忠，等.慢性阻塞性肺病患者ⅠL-4、ⅠL-13以及ADRB2基因多態(tài)性的檢測〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009;30(2):219-23.

4 Melaine C，Matheson A，Johns E，et al.beta2-adrenergic receptor polymorphisms are associated with asthma and COPD in adults〔J〕.Hum Genet，2006;51(11):943-51.

5 Bregger J，Steen VM，Eiken HG，et al.Genetic association between COPD and polymorphisms in TNF、ADRB2 and EPHX1〔J〕.Eur Re-Spir，2006;27(5):682-8.

6 Ranade K，Shue WH，Hung YJ，et al.The glycine allele of a glycine/Arginine polymorphism in the beta2-adrenergic receptor gene is associat-Ed with essential hypertension in a population of Chinese origin〔J〕.Am J Hypertens，2001;14(10):1196-200.

7 朱 建，江時(shí)森，曹 文，等.中國漢族人中beta2-腎上腺素能受體基因多態(tài)性與高血壓病的關(guān)聯(lián)性研究〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2003;16(2):123-6.