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    通用引物多重PCR技術(shù)檢測3種病原微生物

    2011-03-31 03:28:30許文濤元延芳梁志宏翟志芳張雅楠羅云波黃昆侖
    食品科學(xué) 2011年10期
    關(guān)鍵詞:李斯特條帶病原

    商 穎,許文濤,,元延芳,梁志宏,石 慧,翟志芳,張雅楠,羅云波,,黃昆侖,,*

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京),北京 100083)

    通用引物多重PCR技術(shù)檢測3種病原微生物

    商 穎1,許文濤1,2,元延芳2,梁志宏2,石 慧1,翟志芳1,張雅楠2,羅云波1,2,黃昆侖1,2,*

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京),北京 100083)

    為尋找快速且準確的病原微生物檢測方法,在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)的基礎(chǔ)上研究一種新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR)技術(shù)。利用該技術(shù)對食品中主要的3種致病菌——大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌進行同時檢測,經(jīng)過單重PCR驗證、二重以及三重UP-PCR反應(yīng)條件和體系優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法的最低檢測限為0.5pg目標DNA,復(fù)合引物和通用引物的加入量分別為2nmol/L和300nmol/L。此方法檢測靈敏度高、病原菌檢測限低,可在實踐中應(yīng)用。

    大腸桿菌;單增李斯特菌;沙門氏菌;通用引物;多重PCR

    食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),食品安全關(guān)系到人體健康和國計民生,食源性致病菌檢驗更是食品安全檢驗的重中之重。近些年來,世界范圍內(nèi)大規(guī)模的生物性污染引起的食源性疾病爆發(fā)事件屢屢發(fā)生,如日本的出血性大腸埃希菌O157:H7污染、法國的李斯特菌中毒、美國的沙門氏菌屬污染等,食品安全已成為世界性公共衛(wèi)生問題,而以上3種菌也是存在于食物中并且導(dǎo)致食源性疾病的最主要病原菌[1]。

    目前對食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生化鑒定等方法,這些方法不但檢測周期長,而且操作繁瑣復(fù)雜,特異性、靈敏度均較低,無法對人工難以培養(yǎng)的病原細菌進行檢測[2-3],以上缺點都限制了傳統(tǒng)檢測方法的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展,聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、操作簡單,而被廣泛應(yīng)用于食品病原細菌的檢測中。由于單一PCR檢測成本高,食品樣品中往往存在的病原細菌種類很多,有可能涉及不同種和型別的細菌,人們進而開發(fā)了多重PCR技術(shù)[4-6]。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進并發(fā)展起來的一種新型PCR擴增技術(shù),是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物同時擴增多條目的DNA片段的方法[7-8]。但是,通常情況下由于引物的性質(zhì)差異,每個特異性引物的擴增效率不同,擴增產(chǎn)物比例不一致,使得有些目的基因得不到清晰的擴增條帶,有時也會出現(xiàn)假陽性[9]。

    本研究在普通多重PCR的基礎(chǔ)上,建立起一種通用引物——多重PCR技術(shù)(universal primer-multiplex PCR,PU-M-PCR),此技術(shù)可以克服普通多重PCR擴增效率不一致等的缺點,提高檢測靈敏度,降低檢測成本和檢測限,從而為簡便、快速、準確的檢測病原微生物提供一種新方法。

    1 材料與方法

    1.1 菌株以及培養(yǎng)

    沙門氏菌Salmonella spp.(strains CGMCC 1.0090和CGMCC 1.1552) 中國科學(xué)院微生物所;單增李斯特菌L. monocytogenes(strains CMCC 55004和CMCC 55007) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;非致病性大腸桿菌E. coli (BL21)和E. coli (JM109) 本實驗室分離;E. coli O157:H7 EDL933中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病微生物學(xué)研究所景懷奇研究員饋贈。

    菌株凍干粉的活化條件:LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉、10g/L NaCl和15g/L瓊脂)或胰酶解大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(胰酶解大豆酪蛋白肉湯、18g/L瓊脂)、37℃過夜培養(yǎng)。

    活化后細菌的培養(yǎng)條件:選取單菌落于50mL LB液體培養(yǎng)基或500mL胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基,200r/min搖床培養(yǎng)20~22h。

    1.2 基因組DNA提取

    表1 引物序列Table1 Primer sequences used in this study

    純菌培養(yǎng)物基因組提取:2mL菌懸液(OD>1.8) 8000r/min離心5min,1.5mL PBS緩沖液洗滌沉淀并且重懸,反復(fù)兩次。采用優(yōu)化的CTAB法提取細菌基因組DNA[10-11]。

    將基因組DNA溶于300μL TE緩沖液;采用Wizard DNA Purification Kit(美國普洛麥格公司)對DNA進行純化;純化后,用 Pico Green試劑對DNA進行熒光定量。特異性和靈敏性測試時,用雙蒸水稀釋目的基因組。

    1.3 引物序列

    大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的特異引物分別為Ecoli 670-F/R、LM404-F/R、Sal284-R/F[12-14]。UPM-PCR體系中,用于檢測大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的復(fù)合引物在以上3種特異性引物5′端接上一段新序列——CCTTCCTTCCTTCCCCCC,此序列即為本研究新PCR體系中的通用引物UP。各引物序列如表1所示。

    1.4 復(fù)合引物單重PCR特異性驗證

    復(fù)合引物是在普通特異性引物的5′端接上一段序列,其特異性與普通引物特異性是否一致,以及擴增產(chǎn)物片度大小是否相同有待于對比。在此部分的研究中同時進行兩組對比實驗,其中反應(yīng)體系中,一組的引物為普通引物,另一組為復(fù)合引物,其余試劑均相同。熱循環(huán)程序為:94℃變性5min;94℃、30s,56℃、30s,72℃、50s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠電泳分離。

    1.5 通用引物多重PCR(UP-M-PCR)反應(yīng)原理及反應(yīng)條件

    與普通多重PCR體系相比,UP-M-PCR體系中除了含有3對目的基因復(fù)合特異性引物之外,還含有一對通用引物UP。在PCR反應(yīng)的前10個循環(huán),復(fù)合引物主要發(fā)揮作用,進行擴增,而通用引物UP由于沒有目標模板,無法進行擴增。當特異性引物用盡,擴增產(chǎn)物得到一定程度的積累,通用引物開始以得到的產(chǎn)物為模板,進行序列擴增。本研究對此方法的可行性進行驗證。

    UP-M-PCR體系中,復(fù)合引物的特異性根據(jù)溫度溶解曲線-SYBR GREENⅠPCR方法測試[11],并且采用單重、二重、三重PCR對3種引物的比例進行優(yōu)化。由于PCR反應(yīng)中,鎂離子的濃度是影響擴增特異性的一個重要因素[15-17],因此,在UP-M-PCR體系中MgCl2含量為1.8mmol/L,比單重PCR含量稍高。優(yōu)化后的體系為1.8mmol/L MgCl2、200μmmol/L dNTPs和1.5U DNA聚合酶、300nmol/L通用引物、2nmol/L每個復(fù)合引物。模板加入量從500、50、5、0.5、0.05pg依次進行測試,反應(yīng)總體系為30μL,剩余體積用雙蒸水補齊。

    采用梯度PCR進行退火溫度的優(yōu)化,退火溫度范圍為56~64℃。最終熱循環(huán)程序為:94℃變性5min;94℃、30s,60℃、30s,72℃、50s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。

    普通多重PCR中不含通用引物,除了特異引物的含量為300nmol/L,其他試劑量與UP-M-PCR體系相同。熱循環(huán)程序為:94℃變性5min;94℃、30s,56℃、30s,72℃、50s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 復(fù)合引物特異性驗證

    由于復(fù)合引物是在普通引物的5′端加了一段通用引物序列,因此通用引物擴增得到的產(chǎn)物片段較普通引物擴增的產(chǎn)物片段大36bp,所以2、3、4泳道的條帶較5、6、7泳道的條帶位置略低。此部分研究的結(jié)果如圖1所示,每一對引物都得到相應(yīng)特異性的擴增條帶,且目的條帶的亮度相似。說明復(fù)合引物與普通引物對目的片段的特異性一致。

    圖1 復(fù)合引物特異性驗證Fig.1 Verification of the specificity of composite specific primers

    2.2 通用引物單重PCR可行性驗證

    此部分的研究中,一組單重PCR反應(yīng)體系中只加入復(fù)合引物,另一組反應(yīng)體系除了加入復(fù)合引物外,還加入了通用引物,結(jié)果如圖2、3所示。由圖可知,當復(fù)合引物加入量降低到2nmol/L時,已經(jīng)得不到擴增條帶。而當復(fù)合引物量為2nmol/L,同時加入300nmol/L通用引物,得到的條帶依然非常清晰,與圖2第2泳道得到的擴增產(chǎn)物量相當。因此,為了優(yōu)化UP-M-PCR反應(yīng)體系,復(fù)合引物和通用引物的加入量即可分別定為2nmol/L和300nmol/L。

    圖2 復(fù)合引物單重PCR結(jié)果Fig.2 Composite specific primers in single PCR

    圖3 通用引物單重PCR可行性驗證結(jié)果Fig.3 Feasibility of universal primers in single PCR

    2.3 通用引物多重PCR可行性驗證

    圖4 通用引物二重PCR可行性驗證結(jié)果Fig.4 Feasibility of universal primers in duplex PCR

    在反應(yīng)體系中逐漸減少復(fù)合引物的加入量,以優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果如圖4所示,其中706bp和440bp為大腸桿菌O157和單增李斯特菌的特異性條帶。由圖可知,當兩對復(fù)合引物的加入量都在2nmol/L時,已得不到目的條帶;相反,當復(fù)合引物的加入量為2nmol/L,同時加入300nmol/L通用引物,依然可以得到非常清晰的目的條帶。此結(jié)果與2.2節(jié)得到的結(jié)果一致。

    2.4 UP-M-PCR特異性和靈敏度

    為研究同時加入3對復(fù)合引物是否會產(chǎn)生非特異條帶,進行4組多重UP-PCR。每組PCR反應(yīng)體系包括3對復(fù)合引物各2nmol/L、通用引物300nmol/L、模板為3種致病菌基因組DNA的混合物。結(jié)果如圖5所示,其中706、440bp和320bp分別為大腸桿菌O157、單增李斯特菌和沙門氏菌的特異性條帶,每對引物的特異性很高,在整個體系中引物對之間同時存在,沒有出現(xiàn)非特異性條帶。

    圖5 UP-M-PCR特異性驗證結(jié)果Fig.5 Specificity of the developed UP-M-PCR method

    圖6 UP-M-PCR靈敏度驗證Fig.6 Sensitivity of the developed UP-M-PCR method

    靈敏度測試結(jié)果如圖6所示,擴增效率隨模板量減少而降低,同時條帶的清晰度也隨之下降,當模板量減少至0.05pg時,已得不到目的條帶。所以,UP-MPCR的檢測限為0.5pg目標DNA。

    3 討 論

    通用引物三重PCR體系中,反應(yīng)的前10個循環(huán),復(fù)合特異性引物主要發(fā)揮作用,進行擴增,而通用引物UP由于沒有目標模板,無法進行擴增。當特異性引物用盡,擴增產(chǎn)物得到一定程度的積累,通用引物開始以得到的產(chǎn)物為模板,進行序列擴增,最終產(chǎn)生3個不同長度的目的片段。體系中,復(fù)合引物的加入量從200nmol/L減少到2nmol/L時,若不加通用引物,隨著引物量的減少,擴增條帶的清晰度依次降低,直至最后擴增不到擴增條帶。雖然復(fù)合引物的加入量僅為2nmol/L,但通過加入通用引物UP,依然可以得到非常清楚的擴增條帶。因此,復(fù)合引物的最佳反應(yīng)濃度為2nmol/L,約為普通多重PCR反應(yīng)體系中濃度的1%,而通用引物的濃度為正常濃度300nmol/L。因此,UP-MPCR體系中,總的引物含量較普通三重PCR體系更少,僅為其1/4,不僅可以節(jié)約復(fù)合引物消耗,而且通過通用引物消除不用復(fù)合引物之間的擴增性質(zhì)差異。

    在對微生物的檢測中,提高靈敏度和降低檢測限一直是學(xué)者們關(guān)系的問題,在本研究中,通過對模板加入量的研究得到:當混合模板中,其中有一種目標DNA減少到0.5pg時,依然可以擴增到清晰的條帶,而且無非特異性條帶出現(xiàn)。此方法技術(shù)降低了檢測限,提高了檢測的靈敏度,為簡便、快速、準確的檢測病原微生物提供和開辟了一種新方法和手段。對保障食品安全與國民健康具有重要意義。

    [1]代娟, 李玉峰, 楊瀟. 腸道致病菌多重PCR快速檢測體系研究[J].中國公共衛(wèi)生, 2007, 23(2): 219-220.

    [2]張敬平, 吳家林, 肖勇, 等. 沙門菌、志賀茵和副溶血性弧菌的多重PCR快速檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2008, 23(6): 642-645.

    [3]李艷霞, 吳松浩. 食品微生物檢測技術(shù)的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(7): 270-273.

    [4]許一平, 成煒, 陳福生. 多重PCR技術(shù)在食源性病原細菌檢測中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(2): 355-359.

    [5]彭軍, 王國芬, 黃俊生, 等. 香蕉兩種主要病毒多重PCR檢測方法的建立[J]. 園藝學(xué)報, 2006, 33(4): 845-848.

    [6]ELNIFRO E M, ASHSHI A M, COOPER R J, et al. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology[J]. Clin Microbiol Rev, 2000, 13(4): 559-570.

    [7]焦豫良, 張興群, 李振勇, 等. 6種食品致病菌的多重PCR檢測[J].臨床檢驗雜志, 2005, 23(4): 256-258.

    [8]LUTZ E L, KLAUS P H, THOMAS E, et al. A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples[J]. Med Microbiol Immun, 2008, 197(3): 313-324.

    [9]EDWARDS M C, GIBBS R A. Multiplex PCR: advantages, development, and applications[J]. Genome Res, 1994, 3(4): 65-75.

    [10]RICH C, ALFIDJA A, SIROT J, et al. Identification of human enterovirulent Escherichia coli strains by multiplex PCR[J]. J Clin Lab Anal, 2001, 15(2): 100-103.

    [11]MALORNY B, HOORFAR J, BUNGE C, et al. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(1): 290-296.

    [12]MCDANIELS A E, RICE E W, REYES A L, et al. Confirmational identification of Escherichia coli, a comparison of genotypic and phenotypic assays for glutamate decarboxylase andβ-D-glucuronidase[J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(9): 3350-3354.

    [13]WU S J, CHAN A, KADO C I. Detection of PCR amplicons from bacterial pathogens usingmicrosphere agglutination[J]. J Microbiol Methods, 2004, 56(3): 395-400.

    [14]RAHN K S, de GRANDIS S A, CLARKE R C, et al. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella enterica by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella[J]. Mol Cell Probes, 1992, 6(4): 271-279.

    [15]XU Wentao, HUANG Kunlun, WANG Ying, et al. A cotton-specific gene, stearoyl-ACP desaturase, used as a reference for qualitative and real-time quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified organisms[J]. J Sci Food Agric, 2006, 86(7): 1103-1109.

    [16]XU Wentao, BAI Weibin, LUO Yunbo, et al. A novel common single primer multiplex polymerase chain reaction (CSP-M-PCR) method for the identification of animal species in minced meat[J]. J Sci Food Agric, 2008, 88(15): 2631-2637.

    [17]MCPHERSON M J, MOLLER S G. Reagents and instrumentation. In PCR[M]. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd, 2000: 23-66.

    Employing Universal Primers-Multiple PCR to Detect Three Pathogenic Microorganisms

    SHANG Ying1,XU Wen-tao1,2,YUAN Yan-fang2,LIANG Zhi-hong2,SHI Hui1,ZHAI Zhi-fang1,ZHANG Ya-nan2,LUO Yun-bo1,2,HUANG Kun-lun1,2,*
    (1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;2. Supervision, Inspection & Testing Center of Genetically Modified Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

    A fast, accurate and novel universal primers-multiplex PCR (UP-M-PCR) method was developed to detect three common pathogenic microorganisms in food matrices simultaneously: Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp. The specificity of the constructed complex primers was verified by single-PCR, and the duplex and triplex-PCR reaction systems and conditions were optimized. The developed method had a limit of detection of 0.5 pg target DNA. The additions of the complex specific primers and universal primers were 2 nmol/L and 300 nmol/L, respectively. The new UP-M-PCR method has the advantages of high sensitivity and low detection limit and can thus be applied in practice.

    Escherichia coli;Listeria monocytogenes;Salmonella spp.;universal primer;multiplex PCR (polymerase chain reaction)

    Q789;R446.5

    A

    1002-6630(2011)10-0103-04

    2010-06-22

    國家“863”計劃項目(2006AA10Z440);國家自然科學(xué)基金項目(30800770);科技部轉(zhuǎn)基因生物重大專項(2008ZX08012-001)

    商穎(1986—),女,碩士研究生,研究方向為食品安全。E-mail:cauxwt@yahoo.cn

    *通信作者:黃昆侖(1968—),男,教授,博士,研究方向為食品安全。E-mail:hkl009@163.com

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