慢性胰腺炎的動(dòng)物模型選擇*

彭曉華綜述,周旭春審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 400016）

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是由各種原因引起的胰腺組織和功能的不可逆性損傷,主要表現(xiàn)為頑固性疼痛、胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能下降及胰石和假性囊腫的形成。近年來CP的發(fā)病率有所上升,目前認(rèn)為CP不僅與過量飲酒、膽管疾病、胰腺損傷、自身免疫反應(yīng)等有關(guān),而且與遺傳、吸煙、環(huán)境等有關(guān)[1],但是CP確切的發(fā)病機(jī)制仍然不明確。為此學(xué)者們設(shè)計(jì)了各種動(dòng)物模型進(jìn)行了大量研究,本文將其綜述如下。

1 飲食誘導(dǎo)法

Kono等[2]用高脂飲食（200kcal·kg-1·d-1）和乙醇（17～18g·kg-1·d-1）飼養(yǎng)雌性Wistar大鼠8周,發(fā)現(xiàn)乙醇聯(lián)合高脂飲食可刺激淀粉酶和脂肪酶增加,促進(jìn)胰腺纖維化、腺泡細(xì)胞脂肪浸潤和壞死,Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)增加,提示乙醇聯(lián)合高脂飲食可造成胰腺纖維化。近年Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)單純高脂飲食可造成CP的發(fā)生。研究者給予SD大鼠飼以高脂飲食（1%膽固醇、10%豬油、0.3%牛磺膽酸鈉）10周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠血中三酰甘油增加,胰腺組織超氧化物歧化酶增加,組織學(xué)上可見明顯的胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、脂質(zhì)浸潤、間質(zhì)纖維化等慢性炎癥改變,作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著大鼠高脂飲食時(shí)間的延長,胰腺組織的α-平滑肌動(dòng)蛋白（smooth muscle actin，α-SMA）、血小板源性生長因子-β（platelet derived growth factor-β,PDGFR-β）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的表達(dá)也逐漸增加。提示高脂通過促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和激活胰腺星狀細(xì)胞,促進(jìn)膠原合成,導(dǎo)致CP發(fā)生。飲食法誘導(dǎo)的CP模型采用非侵入性方法,操作簡單,適合于探討CP發(fā)病機(jī)制及評價(jià)藥物的干預(yù)作用,但該模型成模時(shí)間較久。

2 自發(fā)性胰腺炎

用富含蛋白質(zhì)、脂肪的特殊飼料MB-3（其中蛋白質(zhì)28.1%、脂肪6%、碳水化合物48.8%）飼養(yǎng)雄性WBN/Kob大鼠,12周后大鼠出現(xiàn)CP表現(xiàn)。Reding等[4]用普通飲食飼養(yǎng)雄性WBN/Kob大鼠12周發(fā)現(xiàn),胰腺腺泡細(xì)胞水腫、凋亡,細(xì)胞間質(zhì)有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤,TGF-β1在腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管上皮細(xì)胞表達(dá)增加,16周時(shí)胰腺小葉融合損傷并有纖維組織替代。Sakaguchi等[5]最近的研究表明,WBN/Kob大鼠用普通飲食飼養(yǎng)8周后即可出現(xiàn)小葉內(nèi)纖維化等CP的改變。該模型的機(jī)制可能是WBN/Kob大鼠對TGF-β1高度表達(dá),后者可以引起胰腺纖維化。該模型胰腺中可見大量的淋巴細(xì)胞浸潤,受損的胰腺組織中CD8+細(xì)胞浸潤和組織特異性的IgG表達(dá)增加,提示與自身免疫反應(yīng)有關(guān)。

該模型方法成熟,操作簡單,成功率高,但缺點(diǎn)是對大鼠的類型有特殊的需求,只有WBN/Kob大鼠才會(huì)出現(xiàn)CP,主要用于研究自身免疫性胰腺炎。

3 腹腔注射法

3.1 二乙基二硫代氨基甲酸鹽（diethyldithiocarbamate,DDC）腹腔內(nèi)注射法 Matsumura等[6]向雄性Wistar大鼠腹腔內(nèi)注射DDC 500mg/kg,每周2次,2周后可見胰腺小葉內(nèi)和小葉間纖維化并伴有腺泡細(xì)胞萎縮,但其他臟器沒有纖維化改變。其原理為DDC可抑制銅/鋅超氧歧化酶（Cu/Zn-SOD）的活性,脂質(zhì)過氧化物增加,通過反復(fù)的氧化刺激導(dǎo)致胰腺纖維化。此法方法簡單、成模時(shí)間短,但是動(dòng)物并發(fā)癥較多,死亡率高。國內(nèi)有學(xué)者[7]采用DDC遞增法及延長成模時(shí)間模擬CP漸進(jìn)性的發(fā)病過程,同樣建成胰腺纖維化模型,降低了并發(fā)癥的發(fā)生率和大鼠的死亡率。

3.2 雨蛙肽腹腔注射法 近年來反復(fù)發(fā)生的急性胰腺炎、胰腺的損傷修復(fù),在CP發(fā)生過程中的作用越來越受到關(guān)注。雨蛙肽可以刺激胰腺外分泌,引起胰腺腺泡細(xì)胞自溶。Perides等[8]通過飲食、乙醇和雨蛙肽共同作用制備小鼠的CP模型,作者給雄性C3H小鼠予以高脂高蛋白飼料8周后,每隔3d向腹腔內(nèi)注射大劑量雨蛙肽,每小時(shí)一次,連續(xù)7次,可見腺泡細(xì)胞周圍有膠原沉積；定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)顯示α-SMA、TGF-β、Ⅰ型膠原纖維和血漿1型組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIM P-1）的表達(dá)明顯增加。該模型主要用于研究胰腺纖維化的影響因素。Gukovsky等[9]給雄性Wistar大鼠乙醇飼養(yǎng)8周,同時(shí)給予腹腔內(nèi)注射雨蛙肽（20μ g/kg）,再給予20mg/kg環(huán)孢菌素A,發(fā)現(xiàn)核因子-к B（nuclear factor kappa B,NF-κ B）表達(dá)增加,膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、9表達(dá)增加,胰腺星狀細(xì)胞激活。此模型中雨蛙肽造成大鼠胰腺損傷,在胰腺損傷修復(fù)過程中,環(huán)孢菌素刺激血清中轉(zhuǎn)化生長因子水平升高,肌成纖維細(xì)胞增生,膠原酶活化及膠原形成,乙醇加重上述損傷,促使胰腺纖維化發(fā)生。雨蛙肽腹腔內(nèi)注射法具有操作簡單、成模時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn),可用于探討CP的發(fā)病機(jī)制和病理生理改變,但是該藥物價(jià)格較貴。

3.3 精氨酸腹腔內(nèi)注射法 有研究者給雄性SD大鼠每日腹腔內(nèi)注射300mg/100g L-精氨酸3周,然后每隔3d腹腔內(nèi)注射同等劑量L-精氨酸3周,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤、纖維化、脂質(zhì)過氧化物和一氧化氮增加。其原理是L-精氨酸影響脂質(zhì)過氧化,促進(jìn)CP的發(fā)生和發(fā)展[10]。

3.4 聚肌胞腹腔內(nèi)注射法 Soga等[11]每3天給具有自身免疫傾向的MRL/Mp小鼠腹腔內(nèi)注射一次聚肌胞（poly I∶C）,12周后胰腺實(shí)質(zhì)為脂肪組織所代替,可見單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等慢性炎癥改變。作者發(fā)現(xiàn)Toll-3受體通過Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用參與CP的發(fā)生。該模型是研究自身免疫性胰腺炎的較好模型。

4 胰管內(nèi)注射法

Kataoka等[12]把黏合劑（成分為玉米蛋白、油酸、三酰甘油、亞油酸）逆行性注射至大鼠胰管內(nèi)制備CP模型。6個(gè)月時(shí)可見胰腺腺體萎縮、不規(guī)則纖維化、CP模型形成。此模型實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長,動(dòng)態(tài)觀察較困難,適合于小導(dǎo)管阻塞引起的CP發(fā)病機(jī)制的研究。

Yamaguchi等[13]給予Wistar大鼠導(dǎo)管內(nèi)注射3%?；悄懰徕c,1周后可見胰腺腺泡細(xì)胞受損、炎癥細(xì)胞浸潤,14d后纖維結(jié)締組織增生,Ⅳ型膠原、MMP-2mRNA表達(dá)增加。Hu等[14]通過胰管內(nèi)注入三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenenze sulfonic acid,TNBS）也成功誘導(dǎo)了大鼠CP,作者研究發(fā)現(xiàn)sonic hedgehog信號通道在該動(dòng)物模型中被激活。胰管內(nèi)注射可以通過破壞胰管上皮細(xì)胞的黏膜屏障,產(chǎn)生氧自由基,導(dǎo)致對胰管上皮細(xì)胞的毒性作用。該模型重復(fù)性較好,病變持續(xù)時(shí)間長,可反映急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)變的動(dòng)態(tài)過程,符合人類CP演變的一般規(guī)律。但是造模過程中大鼠易并發(fā)感染,死亡率較高,而且胰管內(nèi)注射技術(shù)操作要求高。

5 胰導(dǎo)管結(jié)扎法

Kishi等[15]結(jié)扎大鼠胰管,7d后胰腺組織的-SMA表達(dá)增加,出現(xiàn)胰腺萎縮、纖維化和慢性炎癥細(xì)胞浸潤,表現(xiàn)為典型的CP特征。有學(xué)者用結(jié)扎法同樣造成貓、豬的CP模型。Yamamoto等[16]結(jié)扎鼠膽總管,在膽胰管插入導(dǎo)管造成胰管內(nèi)高壓,2周后主胰管內(nèi)可見導(dǎo)管內(nèi)栓子形成,小葉內(nèi)和小葉間纖維化以及炎癥細(xì)胞浸潤,α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)增加,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)顯示TGF-β1mRNA增加。此類動(dòng)物模型通過結(jié)扎胰管,造成胰管內(nèi)壓力增高,導(dǎo)致胰液逆流、腺泡細(xì)胞損傷,從而激發(fā)機(jī)體對損傷的修復(fù),出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化。該模型適用于CP發(fā)病機(jī)制和治療措施的研究,但手術(shù)具有一定的創(chuàng)傷,操作有一定難度。

6 靜脈注射法

6.1 二氯二丁基錫（dibutyltin dichloride,DBTC）靜脈注射法Inoue等[17]將DBTC注入大鼠右頸靜脈,檢測注射后第7、14、28天后胰腺組織的病理改變,發(fā)現(xiàn)在第7天后可見巨噬細(xì)胞浸潤及胰腺實(shí)質(zhì)纖維化,第28天后可見小葉間纖維化,腺泡萎縮明顯,假腺管形成,組織中的胰酶、淀粉酶含量均下降,病變隨著時(shí)間延長而逐漸加重。該造模方法成功率為80%。Vera-Portocarrero等[18]在給大鼠注射DBTC的同時(shí),給予10%的乙醇喂飼,2周后即觀察到胰腺內(nèi)膠原纖維沉積。其原理可能是DBTC破壞腺泡細(xì)胞和胰管上皮細(xì)胞,誘導(dǎo)胰腺炎發(fā)生,壞死細(xì)胞阻塞胰管,導(dǎo)致胰管擴(kuò)張、胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞,造成間質(zhì)纖維化。該方法操作簡單、經(jīng)濟(jì),動(dòng)物死亡率低,造模成功率高,已廣泛應(yīng)用于CP的發(fā)病機(jī)制、病程演變及治療研究中。

6.2 內(nèi)毒素靜脈注射法 長期飲酒者中CP的發(fā)生率增加,而長期飲酒者中常有高內(nèi)毒素血癥發(fā)生。乙醇喂養(yǎng)的大鼠,血漿中內(nèi)毒素水平明顯升高[19]。Vonlaufen等[20]給SD大鼠含乙醇的飼料喂養(yǎng)10周后,每周1次尾靜脈注射內(nèi)毒素,共3次,可見明顯的胰腺腺泡細(xì)胞空泡化和壞死,炎癥細(xì)胞浸潤,纖維結(jié)締組織增生,α-SMA表達(dá)增加,羥脯氨酸增加,說明高內(nèi)毒素血癥對CP的發(fā)生有促進(jìn)作用。該模型可用于CP的發(fā)病機(jī)制研究。

7 病毒感染法

B族柯薩奇病毒（Coxsackievirus B,CVB）已經(jīng)被證實(shí)與胰腺的慢性炎癥有關(guān)。有學(xué)者用8周齡雌性BALB/cByJ小鼠,腹腔內(nèi)感染CVB4-V。結(jié)果顯示,CVB4-V可以誘導(dǎo)小鼠胰腺損傷向CP發(fā)展,出現(xiàn)持續(xù)的炎癥細(xì)胞浸潤、纖維結(jié)締組織增生[21]。Jerrells等[22]在給C57BL/6小鼠攝入6～8周乙醇的基礎(chǔ)上腹腔內(nèi)注射柯薩奇病毒誘導(dǎo)了CP,16d后顯示胰腺有廣泛的膠原沉積。SM A、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）表達(dá)增加。有報(bào)道指出乙醇攝入可以抑制免疫反應(yīng)而增加對病原體的敏感性,由于長期攝入乙醇導(dǎo)致病毒感染遷延不愈,促進(jìn)CP的發(fā)生。在病毒誘導(dǎo)的CP中,IL-10的表達(dá)增加[23]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在柯薩奇病毒誘導(dǎo)的胰腺炎中,細(xì)胞生長、血管再生和凋亡抑制相關(guān)基因表達(dá)增加,提示CP與胰腺癌存在某種程度的相關(guān)性。該模型可用于尋找纖維化發(fā)生的分子病理學(xué)機(jī)制及用于CP與胰腺癌關(guān)系的研究。

8 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

在遺傳性胰腺炎中可檢測到陽離子胰蛋白酶原基因（protease serine 1,PRSS1）突變。Archer等[24]研究發(fā)現(xiàn)通過彈力蛋白酶啟動(dòng)子在胰腺腺泡細(xì)胞表達(dá)突變PRSS1-R122H的轉(zhuǎn)基因鼠。在轉(zhuǎn)基因鼠的胰腺出現(xiàn)早期的胰腺腺泡細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤,隨著轉(zhuǎn)基因鼠年齡的增加,可見胰腺纖維化和腺泡細(xì)胞退行性改變。研究者認(rèn)為PRSS1突變是遺傳性CP的病因,持續(xù)的胰腺損傷可引起CP發(fā)生。轉(zhuǎn)基因CP模型可能是CP動(dòng)物模型研究發(fā)展的一個(gè)方向。

9 其他

微血管的改變在CP的發(fā)生中占有重要地位。將聚苯乙烯微球注入脾動(dòng)脈遠(yuǎn)支或結(jié)扎供應(yīng)胰腺左葉的血管分支,造成胰腺慢性缺血可誘導(dǎo)形成CP。此類模型重復(fù)性及穩(wěn)定性好,但所需人力較多,適合探討胰腺血循環(huán)障礙在CP發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。采用部分結(jié)扎或切斷+結(jié)扎背胰管或背-腹胰管交通支的方法建立的胰腺分裂模型為胰腺分裂癥合并CP患者的外科治療提供了依據(jù)。但制備此模型時(shí)手術(shù)操作對胰腺的創(chuàng)傷大。

10 小結(jié)

上述動(dòng)物模型各具特點(diǎn),有些動(dòng)物模型適于胰腺炎病因?qū)W的研究,有些動(dòng)物模型更適于胰腺炎形態(tài)學(xué)改變的研究。研究者可根據(jù)研究條件和研究需要選擇不同的動(dòng)物模型來復(fù)制CP病程中的某一階段,觀察和探討CP的各方面情況。研究能夠較準(zhǔn)確復(fù)制人類CP,且操作簡便、易重復(fù)、實(shí)驗(yàn)成本低、周期短的模型制備方法,必將成為未來CP實(shí)驗(yàn)研究中的方向。

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