基因芯片技術在休克中的應用

俞曉軍，胡志前

基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)等等，是現代計算機科學、光電物理學、材料學、分子生物學及微電子技術等相關學科高速發(fā)展和相互結合的產物，它具有高度的并行性、高效率、高通量、微型化、自動化等特點，是近年來分子生物學及醫(yī)學診斷技術的重要進展之一。1991年Fodor等［1］首次提出了DNA芯片的概念，決定將硅技術與生物學技術融合在一起，借助半導體技術進行芯片研制，解讀生命有機體在長期進化中累計下來的浩瀚基因信息;1994年美國Affymetrix生物公司的科研人員發(fā)明了DNA芯片原位合成技術［2］;1995年第1塊以玻璃為載體的基因芯片在美國Stanford大學誕生，同年Stanford大學的Schena等［3］發(fā)表了第1篇基因微矩陣的論文;1996年美國Affymetrix生物公司制造出世界上第1塊商業(yè)化的基因芯片，標志著基因芯片技術步入了廣泛研究和應用的高速發(fā)展時期。美國科學促進會將生物芯片評為1998年的十大科技突破之一，認為生物芯片技術將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學技術革命。近年來，隨著各學科相關技術的不斷進步，基因芯片技術的應用范圍不斷擴大，在生命科學研究的多個領域中得到了廣泛的應用。尤其是2001 年人類基因組計劃(humangenome project，HGP)［4－5］測序工作完成后，基因芯片現已成為后基因組時代基因功能分析的最重要的技術之一。本文將重點對基因芯片技術在休克領域里的應用做一綜述。

1 基因芯片技術簡介

基因芯片就是在某種固相載體上(一般為1cm2左右的玻片、硅片和尼龍膜)按照特定的排列方式高密度而有序地排列大量序列已知的cDNA或寡核苷酸片段，形成DNA微矩陣，將樣品DNA/RNA通過PCR/RT-PCR等技術進行擴增和體外轉錄，然后用不同熒光素標記序列或樣品(DNA或cDNA)，使之與芯片上已知的探針序列進行雜交，之后將支持物上未發(fā)生互補結合反應的片段洗去，通過激光共聚焦顯微鏡掃描，借助計算機系統(tǒng)對熒光信號強弱的分析處理，推測出樣品中大量相關基因的定量信息，從而對基因的序列及功能進行研究?；蛐酒夹g的基本原理就是堿基互補、分子雜交［6］，其本質與 Southernblot一致。但 Southernblot是將待測樣品固定于尼龍膜上，與1個特定的經標記的DNA探針雜交，每次只能對1個靶序列進行檢測;而基因芯片技術則是將大量的DNA探針固定于固相基質上，與待測的經標記的DNA樣品雜交，因此只需1次實驗，便能夠將成千上萬的基因表現的形式記錄下來。所以說，與其他基因表達的檢測分析技術相比，基因芯片具有高效、快速、自動化、微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性等優(yōu)點。

目前，基因芯片在生物醫(yī)學的多個領域得到了廣泛的應用。如基因表達譜分析，DNA序列測定，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測［7－8］;藥物篩選和藥理學研究［9］;病原生物學的檢測［10］等等。值得一提的是，在疾病的診治中，基因芯片已被廣泛用于包括腫瘤、遺傳性疾病、傳染性疾病、創(chuàng)傷與修復等在內的幾乎所有病種中，涵蓋了疾病的預防、診斷、治療、預后等各個方面。隨著疾病基因組研究的興起，運用基因芯片尋找各種疾病相關基因的研究會不斷增多，從基因水平去認識和治療疾病也會成為未來醫(yī)學研究中的熱點之一。此外，基因芯片在食品安全檢測、司法鑒定、環(huán)境科學、軍事科學、農林科學等眾多領域都取得了豐碩的成果。

總的來說，基因芯片經過十余年的發(fā)展和改進，已經逐步成熟。相信在不久的將來，基因芯片這項技術在人類的疾病診斷治療和健康管理等眾多領域可以發(fā)揮更為重要的作用。有人說它是后基因組時代研究多基因綜合調控平衡以維持生命表型等內在規(guī)律的最佳手段［11］。隨著新材料、新技術的不斷開發(fā)，基因芯片技術一定會得到進一步的完善和發(fā)展，對人類的生存和發(fā)展產生不可估量的影響。

2 基因芯片技術在休克中的應用

查閱近年來的文獻發(fā)現，盡管基因芯片技術在很多領域受到熱捧，但在休克的研究中卻較少，有據可查的文獻只有10余篇。下面就將基因芯片技術在休克中的應用做一綜述。

2．1 基因芯片在單純失血性休克相關機制研究中的應用Sunder等［12］在定容失血性休克的大鼠模型中利用cDNA芯片技術檢測了失血性休克后1、4、24小時肝臟與應激反應相關的差異表達基因，并同時檢測了與肝臟損傷相關的各種酶指標的變化和肝細胞凋亡的情況。研究結果顯示，在全部23個待檢的與應激相關的基因中，c-jun、c-myc、熱休克蛋白25(Hsp25)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)4種基因在各組中均無表達，超氧化物歧化酶1(SOD1)和瞬時受體電位離子通道蛋白-2(TRPM-2)在各組中表達量最高;從時間點分析，失血后1小時組與對照組相比有13個基因出現了差異表達，其中差異倍值＞2的有6種，p53是惟一1個下調表達的基因;失血后4小時組與對照組相比有10個基因出現了差異表達，而此時p53轉變?yōu)樯险{表達;而到了失血后24小時時僅有4個基因出現了差異表達。經分析后認為，失血性休克引起的大鼠體內與應激相關基因的變化與肝細胞的生存和死亡都有關系，而這兩者之間的平衡關系到最終細胞的生與死。這些基因之間存在著復雜的相互調節(jié)網絡，如果可以進一步闡明它們之間的相互作用并用藥物加以干擾，可能會對休克的治療有益。

Lagoa等［13］在失血性休克的大鼠模型中利用基因芯片技術檢測了與休克中肝臟損傷相關基因的表達變化。該研究發(fā)現，纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)在失血性休克后大鼠肝臟中呈現高表達，這種表達變化與體內纖維蛋白降解產物及白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)等無關，而與轉化生長因子-β1(TGF-β1)、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)的磷酸化等相關，因而推測PAI-1通過干擾肝細胞生長因子的正常表達加重了休克時肝細胞的損傷。

Feinman等［14］利用基因芯片技術研究了創(chuàng)傷失血性休克中肺組織損傷相關基因表達的差異。研究發(fā)現，在休克后3小時時，大鼠肺組織中有139個基因出現了差異表達，其中42個基因與急性肺損傷相關，上調表達的主要有L1反轉錄因子、鳥嘌呤脫氨酶等，下調表達的主要有過氧化氫酶、超氧化物歧化酶1等，這些差異表達基因的生物學功能大部分與細胞應激反應相關。

Zamora等［15］利用基因芯片技術分析了失血性休克大鼠肝臟一氧化氮(NO)誘導的相關基因表達的變化。研究發(fā)現，當增加一氧化氮合酶的活性后，大約有200個基因出現了差異表達，這些基因所編碼的蛋白參與了促炎轉錄因子、細胞因子、細胞因子受體、細胞增殖以及細胞凋亡等多種生物學功能的信號傳導途徑。iNOS可以促進大鼠肝細胞的抗炎和抗凋亡能力，但同時也會抑制細胞的增殖和蛋白質的合成。iNOS會刺激應激相關蛋白的高表達，其中包括亞鐵血紅素合成酶-1(HO-1)，HO-1已被證實在肝臟的缺血再灌注中呈現高表達，當iNOS含量降低時，會加重腸缺血再灌注情況下肝細胞的凋亡，這與此時HO-1的低表達相關。因而得出結論，NO和HO-1在失血性休克中起到十分重要的作用。

2．2 基因芯片在失血性休克+復蘇相關機制研究中的應用Shih等［16］在定壓失血性休克+復蘇的大鼠模型中利用cDNA芯片技術檢測了失血性休克+復蘇后2小時肺臟的差異表達基因。研究結果顯示，與對照組相比，休克組大鼠肺臟有98個基因上調表達，11個基因下調表達，這些基因的表達產物多與炎癥反應、信號傳導、蛋白質的活化、氧化應激、免疫抑制以及細胞凋亡有關。

Alam等［17］在定壓失血性休克+復蘇的大鼠模型中利用cDNA芯片技術檢測了失血性休克+復蘇后3小時脾、肝、肺、肌肉中的差異表達基因，并同時檢測了乳酸林格氏液(LR)、血漿和7．5%高張生理鹽水(HTS)3種不同液體復蘇策略對于基因表達的影響。研究結果顯示，在全部1176個基因中，與對照組相比，休克復蘇后肝臟有63個差異表達基因，其中42個上調，21個下調;肺臟有57個差異表達基因，其中42個上調，15個下調;脾臟有22個差異表達基因，其中20個上調，2個下調;肌肉有25個差異表達基因，其中10個上調，15個下調。從不同的復蘇策略分析，LR組有51個差異表達基因，其中36個上調，15個下調;血漿組有68個差異表達基因，其中44個上調，24個下調;7．5%HTS組有48個差異表達基因，其中34個上調，14個下調。這項研究對休克復蘇后4個臟器的基因表達變化做了全面的檢測，并強調了不同復蘇策略對于細胞在休克刺激下的病理改變中所起到的作用。

Moran等［18］在創(chuàng)傷失血性休克+復蘇的大鼠模型中利用基因芯片技術檢測了創(chuàng)傷失血性休克后大鼠肺臟凋亡相關基因的變化及IL-6治療后的影響和機制。研究發(fā)現，創(chuàng)傷失血性休克會誘導大鼠肺上皮細胞的凋亡，并出現了87%的凋亡相關基因的表達變化;而予以 IL-6治療后，可以使75%的因休克誘導的凋亡相關基因表達恢復正?；?當予以轉錄激活因子3(Stat3)阻滯劑后，會大大降低IL-6的治療作用，使65%的原本由IL-6治療恢復正常表達的凋亡相關基因重新出現異常表達。因此得出結論:創(chuàng)傷失血性休克可以誘導大鼠肺上皮細胞的凋亡，其程度與低血壓持續(xù)的時間相關，IL-6可以通過活化信號轉導和Stat3的途徑來調節(jié)凋亡相關基因的轉錄和表達，對抑制由休克導致的肺細胞的凋亡有重要作用。

2．3 基因芯片在休克治療研究中的應用 Boqner等［19］利用基因芯片技術，通過檢測失血后的輸血治療對多發(fā)傷患者單核細胞信使RNA基因表達的影響，研究輸血治療對于患者免疫應答功能的影響及其機制。其研究發(fā)現，失血后接受大量同型輸血治療的患者，其單核細胞信使RNA有224個基因出現差異表達;而在失血后接受非同型輸血治療的患者，其單核細胞信使RNA有331個基因出現差異表達。這些差異表達基因的功能分析提示多與AKT/PI3激酶途徑、有絲分裂活化蛋白激酶、泛素及多種炎癥調節(jié)通路有關。該實驗結果說明，對多發(fā)傷患者予以輸血治療會導致單核細胞信使RNA基因表達的變化，輸血是影響多發(fā)傷患者預后的獨立影響因素之一，對于輸血的嚴格管理有助于多發(fā)傷患者的恢復。

Alam等［20］在定壓失血性休克的大鼠模型中，利用基因芯片技術研究了低體溫對重癥休克治療的影響。研究發(fā)現，低體溫(15℃)可以明顯降低重癥失血性休克大鼠體內乳酸的含量，并可有效增加大鼠的生存率。低體溫組與對照組相比，有571個基因出現差異表達，其中384個基因上調，187個基因下調。差異基因的功能分析提示，這些基因參與了12條重要信號傳導通路的調節(jié)，其中與急性期反應物相關的基因，如IL-6、IL-10、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等均以上調表達為主，而與代謝途徑相關的基因則以下調表達為主。差異倍值最大的是過氧化物酶增值激活受體γ，它編碼轉錄輔助激活蛋白，與線粒體生物功能、酯類及肝臟其他代謝相關。

總之，休克是體內多基因參與的一個復雜的病理變化過程，時至今日，人們仍未完全闡明休克發(fā)生發(fā)展的相關機制，這也給休克的治療帶來了很大的困擾?；蛐酒鳛楫敶肿由飳W最先進的技術手段之一，為休克的研究提供了有力的支撐。目前，基因芯片用于休克的研究還不是非常廣泛，而且絕大部分研究還是著眼于不同的治療手段對于休克時不同器官功能的影響，其對于休克機制方面的研究還不夠深入，尤其缺乏關于機體本體差異和休克發(fā)生、發(fā)展之間聯系的探討和研究，亦沒有真正發(fā)掘出與休克相關的關鍵性基因。相信隨著基因芯片技術的不斷成熟和進步，它一定會在休克機制的深入研究和新的治療方法的探索中起到越來越重要的作用。

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