明理、細(xì)察、分析
——淺談質(zhì)粒提取實驗的幾個教學(xué)關(guān)鍵點

韋明肯 (玉林師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西玉林537000)

李長秀 (玉林師范學(xué)院圖書館,廣西玉林537000)

梁 鈴 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434023)

質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)技能和基本要求,正確掌握質(zhì)粒提取純化的原理和技巧對學(xué)生的進(jìn)一步學(xué)習(xí)和深造具有重要意義。由于質(zhì)粒是最常用的基因工程載體,質(zhì)粒提取質(zhì)量的好壞直接影響到酶切、連接、轉(zhuǎn)化等后續(xù)實驗,因此通過實驗課培養(yǎng)學(xué)生扎實的質(zhì)粒DNA提取和純化技能對學(xué)生日后的學(xué)習(xí)和工作具有十分重要的意義。由于本科生的分子生物學(xué)實驗內(nèi)容多、時間緊以及受儀器數(shù)量的限制,失敗的實驗一般沒有機(jī)會重復(fù),所以通過有限的教學(xué)實驗達(dá)到理論和實踐的雙重提高是質(zhì)粒提取實驗教學(xué)中的難題。以往的教改研究往往更偏重于質(zhì)粒提取技術(shù)方法的選擇和組合等[1],但教學(xué)實踐中本課題組發(fā)現(xiàn),僅有好的方法并不一定達(dá)到好的教學(xué)效果,一些學(xué)生取得了好的實驗結(jié)果但并不代表其真正理解了實驗。在有限的教學(xué)時間內(nèi),培養(yǎng)學(xué)生從原理上把握實驗,通過一些關(guān)鍵試劑的作用對一些關(guān)鍵現(xiàn)象進(jìn)行解釋的能力甚至比實驗本身的成功更為重要。探索表明,從原理的把握、現(xiàn)象的觀察和結(jié)果分析3個角度進(jìn)行質(zhì)量控制可以有效提高教學(xué)質(zhì)量。簡而言之,即 “明理”、“細(xì)察”和 “分析”。

1 質(zhì)粒提取的原理

從細(xì)胞被裂解后混雜的體系中把質(zhì)粒DNA單獨提取出來對于學(xué)生來講是件很奇妙的事情,而搞清楚提取的原理是學(xué)生消除神秘感和理解實驗的前提。在提取質(zhì)粒時,需要把細(xì)菌的整個細(xì)胞裂解,讓包括染色體DNA、質(zhì)粒DNA、RNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的所有細(xì)胞內(nèi)容物完全釋放出來。因此首先必須弄清楚質(zhì)粒DNA和染色體DNA以及蛋白質(zhì)分離的原理。學(xué)習(xí)的重點和難點是為什么染色體DNA和質(zhì)粒DNA能被分開?即同為DNA,在經(jīng)過一系列的處理后為什么質(zhì)粒DNA能留下來而染色體DNA卻被除去?其中的原理涉及到質(zhì)粒DNA分子的大小、二級結(jié)構(gòu)等信息,以及DNA的變性、復(fù)性與pH之間的關(guān)系等。明白這些原理之后,學(xué)生在實驗過程中才掌握各個步驟之間的因果關(guān)系,有利于學(xué)生對實驗進(jìn)程控制和對結(jié)果進(jìn)行評價、判讀。為了確保學(xué)生的學(xué)習(xí)效果,教師在實驗課開始前布置任務(wù),并在實驗開始前抽樣檢查,要求學(xué)生必須能回答有關(guān)實驗原理的問題,對于不認(rèn)真預(yù)習(xí)的學(xué)生應(yīng)將其實驗推遲。總之,一定要讓學(xué)生進(jìn)入實驗室前明白實驗原理。

2 主要試劑的作用原理

2.1 氫氧化鈉的作用

實驗室中常用堿裂解法小量提取質(zhì)粒,因此堿裂解法是學(xué)生必須掌握的一種細(xì)胞裂解方法。教材中一般很少提及氫氧化鈉裂解細(xì)胞的原理,也很少提及為什么在提質(zhì)粒時選擇堿裂解法而不是其它的細(xì)胞裂解法。氫氧化鈉的作用既能裂解細(xì)胞讓細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來,又是質(zhì)粒DNA和染色體DNA得以分離的關(guān)鍵,因此必須向?qū)W生闡明此問題。在堿裂解法中,氫氧化鈉的作用原理是使細(xì)胞膜由脂雙層結(jié)構(gòu)向囊泡化轉(zhuǎn)變,從而使細(xì)胞裂解。但是對革蘭氏陽性菌來說,提取質(zhì)粒時不能直接使用堿裂解法,而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化,然后才用堿裂解法裂解細(xì)胞。雖然在教學(xué)實驗中不一定進(jìn)行革蘭氏陽性菌的質(zhì)粒提取,但是教師可以通過介紹革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌處理方法的不同,引導(dǎo)學(xué)生復(fù)習(xí)有關(guān)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異,讓學(xué)生深刻認(rèn)識到理論課中關(guān)于細(xì)胞壁成分的組成和結(jié)構(gòu)的知識并不枯燥,而是有著很強(qiáng)的實際應(yīng)用價值。

另外一個問題是:為什么要用堿法裂解細(xì)胞呢?裂解細(xì)菌細(xì)胞的方法很多,有熱裂解法、超聲波破碎法、液氮研磨法、反復(fù)凍融法、SDS裂解法等等。而堿裂解法在提取質(zhì)粒時具有一箭雙雕的作用:一方面是將細(xì)胞裂解,另一方面是形成高堿性的環(huán)境,使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性,為下一步質(zhì)粒DNA的復(fù)性及與染色體DNA分離做準(zhǔn)備。

通過理論闡釋,督促學(xué)生更深入地了解革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的區(qū)別及特點,認(rèn)識到細(xì)胞的裂解方法有很多種,并從理論上認(rèn)識選擇堿裂解法的依據(jù)。

2.2 十二烷基硫酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate,SDS)的作用

在溶液Ⅱ中既有氫氧化鈉,又有十二烷基硫酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate,SDS),既然氫氧化鈉的作用是裂解細(xì)胞,那么SDS的作用又是什么呢?在此處應(yīng)該讓學(xué)生明白,SDS其實也是一種細(xì)胞裂解劑,只是其裂解細(xì)胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。溶液Ⅱ中有了氫氧化鈉,再加入SDS是因為SDS通常用作蛋白質(zhì)的變性劑和助溶劑,它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。幾乎所有的蛋白質(zhì)能溶解在SDS中,甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中,SDS使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。

2.3 溶液Ⅲ的作用及其與溶液Ⅱ的關(guān)系

溶液Ⅲ是5mol/L的醋酸鉀溶液,pH4.8。溶液Ⅲ里既含有醋酸,也含有鉀離子,它們各自發(fā)揮作用。溶液Ⅲ不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉,還使得溶液的酸堿度劇烈下降,避免染色體DNA長時間暴露于強(qiáng)堿環(huán)境而斷裂 (斷裂后就不好去除了),又使得質(zhì)粒可以復(fù)性。一般來說,醋酸可以中和氫氧化鈉的堿性是學(xué)生容易想得到的,但是鉀離子的作用很多學(xué)生就不明白了,而且書上介紹得不多,比如在 《分子克隆實驗指南》中,溶液Ⅲ就是醋酸鉀溶液,但沒有給出理由和解釋[2]。實際上用醋酸鉀的主要原因是溶液Ⅱ中加入了SDS來溶解蛋白,而SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 (potassium dodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此發(fā)生了沉淀。溶液Ⅲ加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽,使得沉淀更完全。由于平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。

當(dāng)然,還需要向?qū)W生說明高鹽條件也會導(dǎo)致SDS形成沉淀,5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環(huán)境促進(jìn)沉淀的原理,有時也可以利用10mol/L醋酸銨來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的溶液Ⅲ(即5mol/L的醋酸鉀,pH4.8)。

3 對主要實驗現(xiàn)象的解釋

對實驗現(xiàn)象的觀察和解釋關(guān)系到學(xué)生根據(jù)實驗現(xiàn)象判斷實驗進(jìn)程是否合理、各實驗步驟完成質(zhì)量以及在實驗偏離預(yù)期時采取措施進(jìn)行補(bǔ)救的能力。對于初次接觸質(zhì)粒提取實驗的學(xué)生來說,還缺少利用原理對一些實驗現(xiàn)象進(jìn)行解釋的能力。因此,實驗課的教師應(yīng)該在實驗進(jìn)程中實時跟進(jìn),對實驗現(xiàn)象進(jìn)行必要的解釋和說明。

3.1 加入溶液Ⅱ后菌液的變化及其與實驗質(zhì)量的關(guān)系

加入溶液Ⅱ以后細(xì)菌迅速被裂解、菌液變得澄清,這是一個明顯而且重要的實驗現(xiàn)象,但是從以往考試檢查的情況看,有部分同學(xué)竟然對這樣一個細(xì)節(jié)毫無記憶,說明這些同學(xué)只是機(jī)械地按照實驗講義上的步驟進(jìn)行操作,沒對實驗現(xiàn)象進(jìn)行觀察和分析。加入溶液Ⅱ后溶液變得澄清、透明、粘稠,在操作中觀察懸液變澄清的程度可以判斷菌體是否裂解完全。如果裂解效果不好,也許是顛倒混勻的次數(shù)不夠,或者所培養(yǎng)的菌體被革蘭氏陽性菌或酵母菌等污染了 (革蘭氏陽性菌的堿裂解效果差),也可能是所配制的溶液出了問題。通過這樣的分析和講解引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會自己分析和解決問題,并根據(jù)這些現(xiàn)象決定實驗是否有繼續(xù)進(jìn)行的必要,有利于發(fā)揮學(xué)生做實驗的主觀能動性。從理論上來講,對這個細(xì)節(jié)觀察和解釋強(qiáng)化了學(xué)生對溶液Ⅱ裂解細(xì)胞作用的認(rèn)識。

3.2 關(guān)于質(zhì)粒電泳條帶的解釋

一般質(zhì)粒電泳出現(xiàn)3個條帶,根據(jù)速度的快慢分別是超螺旋狀結(jié)構(gòu)、開鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)和復(fù)制中間體(即沒有復(fù)制完全的2個質(zhì)粒連在一起)。對于前2條帶一般沒有疑議,至于最后面那條帶 (即最慢的那條帶),有些文獻(xiàn)中將移動最慢的那條帶認(rèn)定為線狀結(jié)構(gòu)[3],但酶切和電泳實驗表明線狀質(zhì)粒的電泳條帶與此條帶位置不同,因此質(zhì)粒電泳中這個最慢的條帶更應(yīng)該是復(fù)制中間體[4]。為了說明第3條帶不是線狀質(zhì)粒,要求學(xué)生在進(jìn)行質(zhì)粒的凝膠電泳時增設(shè)一個線狀質(zhì)粒樣品 (經(jīng)過單酶切作用)作為對照,讓其親自通過實驗看到線狀質(zhì)粒與未酶切質(zhì)粒的3條帶中的任一條帶的位置都不一樣!當(dāng)然也有學(xué)生的質(zhì)粒電泳跑出4條帶,多出的那一條一般是斷裂的基因組DNA,可就此引導(dǎo)學(xué)生回憶提取質(zhì)粒時的操作是否得當(dāng)?比如加入溶液Ⅱ時的操作是否太劇烈,或者是溶液Ⅲ加入的時間較遲等等。

4 實驗報告的撰寫

實驗報告集中體現(xiàn)了學(xué)生對實驗的理解和完成質(zhì)量。由于質(zhì)粒提取實驗的實驗步驟比較程式化,所以在報告中實驗步驟可以寫得簡略一些。但是實驗原理一定要求學(xué)生寫出來,對學(xué)生理解實驗也起到督促和強(qiáng)化的作用。實驗報告的重點應(yīng)放在對現(xiàn)象的描述和實驗結(jié)果的分析、解釋方面。特別是對于一些沒有達(dá)到預(yù)期效果或與正常結(jié)果偏差較大的,應(yīng)重點解釋并分析原因。只有把好實驗報告這個關(guān)口,學(xué)生才能真正從實驗總結(jié)中得到提高,實驗成功了知道成功在哪里,失敗了也明白失敗的原因。

基于分子生物學(xué)實驗的自身特點,本課題組嘗試實驗報告電子化,即學(xué)生只需上交電子版的實驗報告即可。由于電泳結(jié)果不方便繪圖,但可以將電泳圖直接貼在Word文檔中,因此電子實驗報告有利于學(xué)生將電泳結(jié)果等數(shù)字化信息上傳。

5 結(jié)語

培養(yǎng)學(xué)生解決問題的能力是所有教學(xué)的核心和最終目的。分子生物學(xué)是一門以實驗為基礎(chǔ)的實踐性很強(qiáng)的學(xué)科,只有在學(xué)生掌握理論基礎(chǔ)的情況下具備了自主開展實驗的能力,才能算得上教學(xué)的成功。實際上,在老師的指導(dǎo)下很多學(xué)生都能按照講義上的步驟提取到質(zhì)量較好的質(zhì)粒,但是并不是每個提取到質(zhì)粒的同學(xué)都真正掌握了實驗的原理。因此老師不能認(rèn)為學(xué)生提取到了質(zhì)粒就沒問題。筆者在實踐中發(fā)現(xiàn),以 “明理”、“細(xì)察”和 “分析”為指導(dǎo)思想,通過課前預(yù)習(xí)、課中講授以及課后的實驗報告3個環(huán)節(jié)的強(qiáng)化,能明顯提高教學(xué)質(zhì)量,在期末考試中一些關(guān)鍵問題的答題正確率均有明顯提高,證明我們的這種教學(xué)思路和教學(xué)方法對提高實驗課的教學(xué)質(zhì)量有比較好的應(yīng)用價值。

[1]孫曉東,韓立敏,王 轉(zhuǎn),等.質(zhì)粒DNA提取方法的比較[J].陜西教育學(xué)院學(xué)報,2009,25(6):86-88.

[2]金東雁,黎孟風(fēng).分子克隆實驗指南 [M].北京:科學(xué)出版社,1992:928.

[3]劉漢明.質(zhì)粒在細(xì)菌致病性中的作用與新菌苗研制的展望 [J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,1984,(1):5-16.

[4]滕 云.兩種質(zhì)粒DNA純化方法的比較[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2009,66(1):28-29.