原生質體技術在蔬菜育種中的應用進展

孫 賀，劉樂承 （長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025）

原生質體是除去細胞壁后得到的微球體［1］。原生質體技術是指在原生質體分離基礎上進行的一系列技術操作，主要包括原生質體融合、遺傳轉化、植株再生等［2］。自從1960年Cocking首次用纖維素酶制備番茄根原生質體獲得成功，迄今已有46個科160多個屬360多種植物的原生質體再生植株問世，80多種科間、屬間、種間或品種間細胞融合獲得胞質種［3-5］。近年來，人們將原生質體技術廣泛應用于蔬菜育種工作中，并取得了令人矚目的成果，獲得了甘藍和白菜［6］、蕃茄［7-8］、油菜［9］、蘿卜［10］等體細胞雜交植株。

1 原生質體植株再生技術及變異

1．1 原生質體植株再生途徑

原生質體再生植株的形成有以下途徑［4，11］：細胞團發(fā)育形成愈傷組織，經(jīng)分化形成植株；愈傷組織分化形成胚狀體，再發(fā)育成植株；直接形成胚狀體，再發(fā)育成植株。

1．2 原生質體再生植株變異

黃瓜的再生植株多為四倍體或者是多倍體，形態(tài)表現(xiàn)為株型矮小，節(jié)間粗短，葉片深綠、小而厚硬，早花早果［12］。李耿光等［13］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的再生植株葉片出現(xiàn)了披針形、匙形和腫脹現(xiàn)象，葉片表現(xiàn)不一致，莖桿粗細不均。大白菜的再生植株可以得到二倍體［14］。但是，葉肉原生質體再生植株具有正常四倍體的頻率很低，而非整倍體頻率很高，染色體變異明顯。而熊新生［15］發(fā)現(xiàn)在甘藍原生質體再生的無性系中也有高頻率的染色體倍性的變異。

1．3 原生質體再生植株變異的原因

再生植株的變異受實驗過程中外界條件的影響比較大。首先，原生質體的來源多種多樣，變異類型也因植物種類、品種而異。同時分離原生質體的植物材料本身對變異的影響也很大，使用無性繁殖的植物更易發(fā)生變異。對于甘藍，主要是從子葉、根、葉片、下胚軸等分離出原生質體［16］。其次，同一種類的植株采用的原生質體來源不同，再生植株的變異也各不相同。再次，各個培養(yǎng)條件是經(jīng)過研究探索發(fā)現(xiàn)的，這種人工創(chuàng)造的條件無法與真正的細胞環(huán)境條件相比。而外源激素對原生質體培養(yǎng)的影響也比較顯著，其他影響因素也不容忽略。

2 原生質體融合和細胞雜交技術在蔬菜育種中的應用

原生質體融合就是2種異源原生質體，在誘導劑的誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合，再經(jīng)過細胞壁再生形成雜種細胞的過程［17］。細胞雜交包括體細胞雜交、不對稱細胞雜交、體細胞和性細胞雜交和微細胞雜交。不對稱細胞雜交產(chǎn)生具有1個親本的細胞核和2個親本的細胞質的體細胞雜種［4］，可以克服有性雜交不親和以及增加育種工作中變異［18］。

2．1 獲取并轉移外源遺傳物質，進行遺傳轉化

原生質體是進行非載體遺傳操作的良好受體，可以直接攝取外源物質，包括細胞核、細胞器基因組、DNA片斷及病毒顆粒，直接進行基因轉化，是進行遺傳轉化研究的理想工具。Mukhopadhyay等［19］報道，甘藍下胚軸原生質體在PEG的介導下，直接攝取抗潮霉素的標記基因的質粒DNA，轉化頻率10%～30%，而且獲得了轉化再生植株。由此可見，細胞質融合技術明顯優(yōu)于有性雜交是因為可以對細胞質進行遺傳操作，從而引起各種細胞器的重組。體細胞雜交創(chuàng)造變異的潛力很大，能夠豐富種質資源，保持和促進生物多樣性。

2．2 原生質體融合獲得胞質雜種

胞質雜種可以通過以下3種途徑產(chǎn)生：1個正常的原生質體與1個去核的原生質體融合；1個正常的原生質體與1個核失活的原生質體融合；融合以后的某一階段1個親本的核或者染色體被排除［4］。

體細胞雜種綜合了雙親的全部性狀，雙親所有的遺傳物質都會影響雜種后代的表現(xiàn)，所以對體細胞雜交后代的改良也是一個艱巨的工程，而胞質雜種有望減輕這一工程的工作量，可能會解決對稱融合倍性增加和優(yōu)劣性狀均進入雜種的問題［20］。另外，非對稱雜交時，受體親本多倍化可以緩沖外來基因組產(chǎn)生的某些負效應［21］；進行對稱雜交時，親本的倍性高可能會造成基因組間不協(xié)調(diào)、重組復雜等，給選擇有用雜種后代增加難度，因此對稱體細胞雜交常與花藥培養(yǎng)相結合，來進行優(yōu)良基因的組合［22］。若對野生親本先進行花藥培養(yǎng)再進行體細胞雜交，會使體細胞雜種在形態(tài)上更接近栽培親本，有利于得到利用價值高的體細胞雜種［23］。

2．3 實現(xiàn)遠源遺傳重組，創(chuàng)造新的育種材料，培育新品種

原生質體融合在一定程度上克服雜交育種中諸如不親和性、性器官敗育障礙等，獲得雜種，但親緣關系越遠，獲得遺傳上穩(wěn)定的雜種難度越大［24］。在甘藍育種中，種間的和屬間的雜種為甘藍品種改良提供了豐富的變異類型［25］。Schenck等［26］首次獲得了甘藍與白菜的體細胞雜種。白菜型油菜與甘藍進行體細胞雜交得到了合成種［4］。番茄與類番茄進行種間雜交得了體細胞雜種［27］。Horita等［28］得到了百合屬體細胞雜交的后代。通過體細胞雜交也可以提高植株的抗逆性。李省印等［29］新育出的 “優(yōu)生1號”平菇品系，經(jīng)栽培試驗發(fā)現(xiàn)其適應性強、優(yōu)質、豐產(chǎn)、抗雜、耐熱。一些野生種中，有許多抗蟲、抗病、抗旱、耐鹽堿、抗高溫等優(yōu)良性狀，將栽培植物與野生種作為親本，經(jīng)過原生質體融合、選擇與再生，從而獲得野生種的抗逆特性。

3 存在問題與展望

原生質體技術本身也還存在一些問題，首先原生質體植株再生的難易會直接影響體細胞雜交育種的成敗。其次，誘導融合過程中的許多因素會直接影響到原生質體的活力、融合率，使得誘導物質的使用、融合方法的選擇顯得很重要，所以應進一步進行提高融合頻率的研究，尤其是電融合技術在原生質體融合中的應用研究更要加強［30］。再次，體細胞雜種或胞質雜種本身染色體數(shù)目不確定，而且染色體結構易發(fā)生變異，以及存在異常的減數(shù)分裂等，造成培養(yǎng)過程中出現(xiàn)不穩(wěn)定的問題。此外，體細胞雜交育種同樣存在雜種不育或育性差的問題。

當某一性狀的遺傳基礎不明確或存在多基因或胞質基因控制的情況下，進行有關基因的轉移是目前利用基因工程手段還無法實現(xiàn)的，而體細胞雜交則能實現(xiàn)這類基因的轉移［31］。原生質體技術的應用不僅僅培育了一批優(yōu)良品種，更催生了一大批先進實用的研究成果和技術。在大力推廣常規(guī)脫毒和快繁技術的同時，加快發(fā)展植物快繁生物反應器，將為種苗業(yè)帶來新的變革。應用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)植物來源的生物產(chǎn)品，盡管目前僅在少數(shù)植物上實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但隨著植物細胞工程生物反應器技術的完善，其應用領域將進一步擴大。

原生質體技術在種質創(chuàng)新和品質改良上顯示了巨大潛力，并不意味著它可以完全取代常規(guī)育種技術。正如社會發(fā)展到今天，紙張依然無法取代一樣。所以原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交技術與遺傳轉化技術相輔相成，與常規(guī)育種技術結合起來，將為植物基因組之間的結合和相互作用以及新品種的培育提供無限的可能性［11］。

［1］郭 勇，崔堂兵，謝秀禎 ．植物細胞培養(yǎng)技術與應用 ［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2003：51-53．

［2］于曉玲，李春強，彭 明 ．植物原生質體技術及其應用 ［J］．中國農(nóng)學通報，2009，25（8）：22-26．

［3］Cocking E C．A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles［J］．Nature，1960，187：927-929．

［4］許智宏，衛(wèi)志明 ．植物原生質體培養(yǎng)和遺傳操作 ［M］．上海：上海科學技術出版社，1997：20-30．

［5］朱至清 ．植物細胞工程 ［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2003：164-167．

［6］劉繼紅，徐小勇，鄧秀新 ．原生質體再生植株變異及其在植物育種上的應用 ［J］．華中農(nóng)業(yè)大學學報，2003，22（3）：301-306．

［7］姜國勇，郭寶太，金德敏，等 ．番茄高效植物再生體系及基因轉化體系的建立 ［J］．萊陽農(nóng)學院學報，1998，15（2）：84-88．

［8］田志宏，孟金陵 ．甘藍型油菜原生質體培養(yǎng)及植株再生的研究 ［J］．中國油料作物學報，2002，24（2）：10-13．

［9］Yu G H，Deng X X．Two interspecific somatic hybrids of citrus produced via protoplast electrofusion［J］ ．華中農(nóng)業(yè)大學學報，2000，19 （3）：268-273．

［10］胡開林，付群梅，汪國平，等 ．黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因轉化番茄的研究 ［J］．華南農(nóng)業(yè)大學學報，2002，23（4）：34-36．

［11］李 杰，黃敏人，王命庥，等 ．植物原生質體培養(yǎng)和體細胞融合技術研究進展 ［J］．仲愷農(nóng)業(yè)科學院學報，2003，16（4）：64-71．

［12］郭德章，鄢 錚，賴鐘雄，等 ．“翠秀”黃瓜子葉原生質體的高效培養(yǎng)及植株再生 ［J］．園藝學報，2003，30（2）：227-228．

［13］李耿光，張?zhí)m英，陳如珠 ．馬鈴薯原生質體再生植株表現(xiàn)弄變異和染色體數(shù)目變化 ［J］．植物學報，1992，34（9）：712-716．

［14］張鳳蘭，釘貫靖久 ．大白菜小孢子再生植株自然加倍率的探討 ［J］．北京農(nóng)業(yè)科學，1993，（4）：23-25．

［15］熊新生，賈士榮，傅幼英 ．甘藍原生質體無性系的變異 ［J］．園藝學報，1988，15（2）：120-124．

［16］李 云，馮 慧，田硯亭 ．葡萄遺傳轉化研究進展 ［J］．生物工程進展，2000，20（3）：49-52．

［17］司懷軍，戴朝曦，于品華，等 ．菊花幼嫩花瓣愈傷組織的誘導和植株再生 ［J］．甘肅農(nóng)業(yè)科學學報，1998，33（2）：175-177．

［18］Glimelius K，F(xiàn)ahlesson J，Landgren M，et al．Gene transfer via somatic hybridization in plants［J］．Trends Biotechnol，1991，9：24-30．

［19］Mukhopadhyal A，Topfer R，Pradhan A K，et al，Efficient regeneration ofBrassicaoleraceahypocotyla protoplasts genetic and high frequency transform at ion by direct DNA uptake［J］．Plant Cell Rep，1991，10：375-395．

［20］朱德蔚 ．植物組織培養(yǎng)與脫毒快繁技術 ［M］．北京：中國科學技術出版社，2001．

［21］Obeiwalder B，Schide R L，Ruob B，et al．A symmetric protoplast fusions between wild species and breeding lines of potato-effect of recipients and genomest ability［J］．Theoretical and Applied Genetics，1998，97：1347-1354．

［22］Rokka V M，Taurinen A，Pietila L，et al．Interspecific somatic hybrids between wild potatoSolanumacauleBitt and anther-derived dihploid potato（SolanumtuberosumL）［J］．Plant Cell Reports，1998，18：82-88．

［23］閏 靜，張明方，陳利萍 ．體細胞雜交技術在蔬菜育種中的研究與應用 ［J］．細胞生物學雜志，2004，26（1）：51-56．

［24］Escalante A，Imanishi S．RFLP analysis and genomic in situ hybridization（GISH）in somatic hybrids and their progeny betweenLycopersiconesculentumand［J］．Theoretical and Applied Genetics，1998，96 （6-7）：719-726．

［25］李衛(wèi)東，王文江，劉永居，等 ．柿現(xiàn)代生物技術研究進展 ［J］．中國蔬菜，2003，19（1）：58-61．

［26］Schenck H R，Robblen G．Somatic hybrids by fusion protoplasts fromBrassicaoleraceaandB．compestris［J］．Z Pflanzenzuchty，1982，89：278-288．

［27］Kobayashi S，Ohgawara T，Saito W，et al．Production of triploid somatic hybrids in citrus［J］．Jpn Soc Hort Sci，1997，66：453-458．

［28］Horita M，Morohashi H，Komai F．Production of fertile somatic hybrid plants between Oriental hybrid lily andLilliumformolongi［J］．Plant，2003，217 （4）：597-601．

［29］李省印，李孟樓，胡彩霞，等 ．平菇種內(nèi)原生質體分離與融合雜交技術研究 ［J］．生物技術通報，2004，（11）：580-583．

［30］田志宏，孟金陵 ．蕓薹屬作物原生質體融合及基因轉移 ［J］．中國油料，1997，19（1）：70-75．

［31］劉擁海，俞 樂 ．植物體細胞不對稱雜交研究進展 ［J］．生物學雜志，2004，21（2）：10-13．