超聲提取鼠尾草葉多糖工藝優(yōu)化及其DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)

祝元婷，吳文林，張 利*，劉 琪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

超聲提取鼠尾草葉多糖工藝優(yōu)化及其DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)

祝元婷，吳文林，張 利*，劉 琪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

以鼠尾草(Salvia officinalis L.)葉為材料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探討超聲提取其多糖的最佳工藝條件，并利用1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除法評(píng)價(jià)該多糖的自由基清除能力。結(jié)果表明：超聲提取多糖的最佳工藝條件為：提取時(shí)間7min、提取2次、料液比1∶40，在此條件下鼠尾草葉多糖的提取率為3.27%。同時(shí)該多糖對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為160μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到82%，并且對(duì)DPPH自由基清除能力IC50為112μg/mL。

鼠尾草；多糖；超聲提??；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)

唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬植物鼠尾草(Salvia officinalis L.)，又名撒爾維亞、廚房鼠尾草、達(dá)爾馬希亞鼠尾草，為多年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲地中海地區(qū)[1]。在國(guó)外，廣泛飲用“鼠尾草茶”，并常常將其作為廚房用的香草，用作防腐、烹飪的調(diào)味料等。

根據(jù)國(guó)外研究結(jié)果，鼠尾草具有防腐抗菌[2]、抗氧化[3]、抗突變[4]、保護(hù)腸胃[5]、消炎[6-7]和調(diào)節(jié)免疫[8]等作用，其多糖具有免疫[8-10]、抗氧化[11]等活性。我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始在上海、北京等地引種鼠尾草，并對(duì)其精油抗菌活性[12]、葉提取物抗氧化作用[13]等進(jìn)行一些研究，但尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)關(guān)于鼠尾草多糖的研究。

目前，國(guó)外已有對(duì)鼠尾草葉多糖的研究，采用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取[14]。近年來(lái)，超聲波、微波、酶等提取方法，已廣泛應(yīng)用于多糖的提取[15]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法對(duì)鼠尾草葉多糖的提取工藝進(jìn)行研究，并評(píng)價(jià)其DPPH自由基清除能力，旨在為鼠尾草天然保健品的開(kāi)發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠尾草，由美國(guó)國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)(national plant germplasm system，NPGS)提供，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為唇形科植物鼠尾草(Salvia officinalis)；DPPH(分析純) 美國(guó)Sigma公司；甲醇、氯仿、乙醇和正丁醇(均為分析純) 成都科龍化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī) 天津泰格斯儀器有限公司；UV-3200PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；JP99-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化設(shè)備儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠。

1.3 多糖的提取及含量測(cè)定

鼠尾草葉60℃烘干、粉碎，過(guò)60目篩；甲醇∶氯仿(10∶1，V/V)回流5h；揮干溶劑，繼續(xù)用80%乙醇回流5h，干燥粉碎備用；準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g(精確至0.1mg)材料粉末，加入超純水，使用超聲波粉碎儀提取，提取液定容至100mL，即得多糖提取液。苯酚-硫酸法[16]測(cè)定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，用UV-3200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)作比色分析。

1.4 影響多糖提取率的單因素和正交試驗(yàn)

1.4.1 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

采用料液比1∶50，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 m i n，以鼠尾草葉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同提取時(shí)間對(duì)鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.2 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

采用料液比1∶50，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，以鼠尾草葉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同提取次數(shù)對(duì)鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.3 不同料液比對(duì)多糖提取率的影響

采用提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，以鼠尾草葉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同料液比對(duì)鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.4 鼠尾草葉多糖提取工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比為3因素，各取3個(gè)水平，用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以鼠尾草葉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提取鼠尾草葉多糖的最佳提取工藝。

1.5 DPPH自由基清除活性

1.5.1 鼠尾草葉多糖的純化

稱(chēng)取50g材料，按最佳工藝進(jìn)行超聲提取。將提取液按Y a n g等[17]報(bào)道方法純化：將提取液濃縮至400mL，并加入95%(V/V)的乙醇水溶液，醇沉，于4℃放置12h。所得粗多糖沉淀用100mL水進(jìn)行溶解，用Sevag法除蛋白，脫蛋白溶液用超純水透析48h，然后用4倍體積的95%乙醇溶液再沉淀。沉淀物分別采用無(wú)水乙醇和丙酮進(jìn)行洗滌，然后干燥得多糖樣品，備用。

1.5.2 清除率測(cè)定

參考Capek等[11]方法測(cè)定DPPH自由基清除率，并以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。將多糖和VC溶于水中，并分別配制成6個(gè)梯度的多糖和VC溶液(10、20、40、80、160、320μg/mL)，分別取2mL上述溶液和2mL DPPH溶液(0.08mg/mL)于三角瓶中，混合搖勻，室溫下靜置30min，在517nm處以空白作對(duì)照測(cè)定吸光度。自由基清除能力按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：ADPPH為未加入多糖樣品或VC的DPPH溶液的吸光度；A樣品為DPPH溶液加多糖樣品或VC后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取鼠尾草葉多糖單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖1 超聲時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)和料液比(C)對(duì)多糖提取的影響Fig.1 Effects of ultrasonic treatment time, number of extractions and material-to-liquid ratio on polysaccharide yield

由圖1A可知，隨著提取時(shí)間的增加，多糖的提取率提高，在提取時(shí)間6min時(shí)，多糖提取率最高。當(dāng)提取時(shí)間大于6min后，多糖提取率不再增加，反而有所降低。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于超聲波的空化效應(yīng)，固液擴(kuò)散速度加快，有利于多糖的浸出；而當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，且溶劑蒸發(fā)較快，都將影響多糖的提取率。所以，選擇5、6、7min作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.2 超聲提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

由圖1B可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率升高。當(dāng)提取次數(shù)大于3后，提取率增幅趨于平緩。這是因?yàn)樵谒O(shè)定的超聲提取條件下，經(jīng)3次提取，大部分多糖已經(jīng)提取出，繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖提取率的增加不明顯。所以，選擇2、3、4次作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.3 超聲提取料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖1C可知，在料液比為1∶30時(shí)多糖提取率達(dá)到最大，此后，隨著液料比的增加，多糖提取率迅速降低，其原因可能在于過(guò)大的溶劑體積，使超聲波在液體中的空化效應(yīng)不均勻，底層的樣品粉末所受的空化效應(yīng)偏低，導(dǎo)致多糖提取率降低。所以，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2 鼠尾草葉多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇的3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鼠尾草葉多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance for polysaccharide yield with various extraction conditions

由表1R值可知，影響多糖提取率的因素主次關(guān)系為C(料液比)＞B(提取次數(shù))＞A(提取時(shí)間)，即料液比對(duì)多糖提取率的影響最大。由表2方差分析可知，C(料液比)對(duì)鼠尾草葉多糖的超聲提取率具有極顯著影響，B (提取次數(shù))對(duì)多糖的提取率具有顯著影響，而A(提取時(shí)間)對(duì)超聲法提取鼠尾草多糖的提取率無(wú)顯著性影響。

綜上所述，最優(yōu)工藝組合條件為A3B1C3，即正交試驗(yàn)中的第7組試驗(yàn)，即鼠尾草葉多糖提取的最佳工藝條件為提取時(shí)間7min，提取次數(shù)2次，料液比1∶40，在此條件下多糖提取率為3.27%。

2.3 DPPH自由基清除活性

圖3 鼠尾草多糖的清除作用Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of VC and polysaccharides from Salvia officinalis L. leaves

由圖3可以看出，該多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度10μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為54.04%，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除作用增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在10～160μg/mL時(shí)，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為160μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到82%。此后，繼續(xù)增大多糖的質(zhì)量濃度，其清除率提高趨于平緩。同時(shí)，從分析可得，鼠尾草葉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力IC50為112μg/mL。由此可見(jiàn)，該多糖的自由基清除作用相當(dāng)顯著。

3 結(jié) 論

采用超聲提取鼠尾草葉多糖的最佳工藝條件為提取時(shí)間7min，提取次數(shù)2次，料液比1∶40，在此條件下鼠尾草葉多糖的提取率為3.27%。同時(shí)該多糖對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用，IC50值為112μg/mL，并且當(dāng)質(zhì)量濃度為160μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到82%。

[1]吳征鎰, 李錫文. 中國(guó)植物志∶ 第66卷[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 1977∶140-141.

[2]BOUAZIZ M, YANGUI T, SAYADI S, et al. Disinfectant properties of essential oils from Salvia officinalis L. cultivated in Tunisa[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(11)∶ 2755-2760.

[3]LU Y R, FOO L Y. Antioxidant activities of polyphenols from sage[J]. Food Chemistry, 2001, 75(2)∶ 197-202.

[4]FILIPIC M, METKA F, BARICEVIC D, et al. Antimutagenic activity of Salvia officinalis extracts against UV induced mutations in E. coli strains[J]. Mutation Research, 1997, 379(1)∶ 182-183.

[5]MAYER B, BAGGIO C H, FREITAS C S, et al. Gastroprotective constituents of Salvia officinalis L.[J]. Fitoterapia, 2009, 80(7)∶ 421-426.

[6]BODIRLAU R, SPIRIDON I, TEACA C A, et al. Anti-inflammatory constituents from different plant sepecies[J]. Environmental Engineering and Management Journal, 2009, 8(4)∶ 785-792.

[7]BARICEVIC D, SOSA S, DELLA LOGGIA R, et al. Topical antiinflammatory activity of Salvia officinalis L. leaves∶ the relevance of ursolic acid[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2001, 75(2/3)∶ 125-132.

[8]CAPEK P. Water-soluble polysaccharides from Salvia officinalis L. possessing immunomodulatory activity[J]. Phytochemistry, 2004, 65 (13)∶ 1983-1992.

[9]CAPEK P. A water soluble glucomannan isolated from an immunomodulatory active polysaccharide of Salvia officinalis L.[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 75(2)∶ 356-359.

[10]CAPEK P, HRIBALOVA V, SVANDOVA E, et al. Characterization of immunomodulatory polysaccharides from Salvia officinalis L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 33(1/3)∶ 113-119.

[11]CAPEK P, MACHOVA E, TURIAN J. Scavenging and antioxidant activities of immunomodulating polysaccharides isolated from Salvia officinalis L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 44(1)∶ 75-80.

[12]QIU Huixia, YAO Lei, HONG Limei, et al. Seasonal analyses of the essential oil of Salvia officinalis L. cultivtated in shanghai of China[J]. Journal of Shanghai Jiaotong University (Agricultural Science), 2005, 23(3)∶ 213-218.

[13]秦海燕, 陳季武, 胡斌, 等. 鼠尾草葉提取物清除自由基、抗氧化作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(7)∶ 89-92.

[14]HROMADKOVA Z, EBRINGEROVA A, VALACHOVIC P. Comparison of classical and ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Salvia officinalis L.[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 1999, 5(4)∶163-168.

[15]徐春龍. 超聲提取中草藥成分研究進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志, 2007, 27 (6)∶ 933-937.

[16]徐曉飛, 陳健. 多糖含量測(cè)定的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21)∶443-448.

[17]YANG Xiaoming, YU Wei, QU Zhongping, et al. Antioxidant and imuunity activity of water extract and crude polysaccharide from Ficus carica L. fruit[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 2009, 64 (2)∶ 167-173.

Optimization of Ultrasonic Extraction of Polysaccharides from Salvia officinalis L. Leaves and Their DPPH Free Radical Scavenging Activity

ZHU Yuan-ting，WU Wen-lin，ZHANG Li*，LIU Qi
(College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China)

The conditions for ultrasonic extraction of polysaccharides from Salvia officinalis L. leaves were optimized by onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods. A material-to-liquid ratio of 1∶40 for 7 min extractions performed twice proved optimal. The resultant polysaccharide yield was 3.27%. The polysaccharide extract obtained had excellent DPPH free radical scavenging effect, revealing a scavenging rate of 82% at the concentration of 160μ g/mL and an IC50 of 112μ g/mL.

Salvia officinalis；polysaccharide；ultrasonic extraction；1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

TQ929.2

A

1002-6630(2011)16-0076-04

2010-11-22

四川省青年科技基金資助項(xiàng)目(08ZQ026-034)；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2008FZ0148；2008SZ0074)

祝元婷(1990—)，女，學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail：zhuyuantingwode@163.com

*通信作者：張利(1969—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zhang8434@sina.com