飼糧添加25-羥基維生素D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物抗體和細胞因子水平的影響

廖 波 張克英＊ 丁雪梅 徐志文 白世平

腹瀉是斷奶仔豬生產(chǎn)中危害較大的疾病,嚴重危害仔豬生產(chǎn)。斷奶時期免疫功能低下、消化道發(fā)育不完善是仔豬對病原體抵抗差,易發(fā)生腸道疾病的重要原因[1-5]。因此,如何通過營養(yǎng)措施調(diào)節(jié)免疫反應來對抗疾病,從而實現(xiàn)提高仔豬生產(chǎn)的目的成為動物營養(yǎng)學研究的熱點。近30年的研究證實,維生素D3,主要是其激素活性形式1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2-D3],不僅在傳統(tǒng)鈣磷穩(wěn)衡中發(fā)揮著重要作用,在調(diào)節(jié)動物機體的免疫反應中也起著重要作用[6]。1,25-(OH)2-D3能調(diào)節(jié)T細胞、B細胞和巨噬細胞的分化、成熟、分泌細胞因子和免疫球蛋白[7-10]。在畜禽上的研究顯示,1,25-(OH)2-D3對豬[11-12]和牛[13]的免疫功能有重要影響。25-OH-D 3是維生素D3在飼料生產(chǎn)中的最新應用形式,與普通的維生素D 3相比在吸收轉運方面有突出的優(yōu)勢[14]。因此,在斷奶仔豬飼糧中添加25-OH-D3是否能更好地發(fā)揮維生素D3的免疫調(diào)節(jié)功能值得研究。本試驗擬在輪狀病毒感染斷奶仔豬的條件下,研究飼糧添加高水平的25-OH-D 3對斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物抗體和細胞因子水平的影響,旨在為25-OH-D3在仔豬飼糧中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.25 %25-OH-D3(1 μg=40 IU,DSM)、其他單體維生素(Bayer)、MEM 液(Gibco)、胰蛋白酶抑制劑(Sigma)、亮抑蛋白酶肽(Sigma)。

1.2 試驗動物及飼糧

試驗動物選用48頭28日齡斷奶的平均體重為(7.35±0.75)kg的杜長大三元雜交仔豬。試驗飼糧參照美國NRC(1998)5～10 kg階段生長豬的營養(yǎng)需要配合成粉狀全價料,基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼糧添加 220 IU/kg(5.5μg/kg)的25-OH-D3,試驗組飼糧添加2 200 IU/kg(55.0μg/kg)的 25-OH-D3(為 NRC推薦量的10倍)。

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗采用2×2雙因子設計,C-、C+組分別為未攻毒和攻毒對照組,T-、T+組分別為未攻毒和攻毒試驗組。所選仔豬按體重相近原則隨機分配到4個組中(每組12個重復,每個重復1頭豬),單籠飼養(yǎng),未攻毒處理和攻毒處理各飼養(yǎng)在1間隔離環(huán)境控室內(nèi)。試驗期21 d。舍內(nèi)溫度保持在25～28℃。飼養(yǎng)管理按常規(guī)飼養(yǎng)管理進行,仔豬自由采食飲水。

1.4 病毒接種

攻毒試驗采用的病毒為人輪狀病毒(HRV)Wa株,由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術中心提供。在試驗第0天08：00,攻毒處理的每頭仔豬用注射器灌服輪狀病毒1 mL(輪狀病毒濃度為 1×106TCID 50/mL),未攻毒處理的每頭仔豬用同樣方式灌服同體積MEM液。

1.5 樣品采集與制備

在試驗第0、5、15、21 天的 08：00,每組分別隨機選取6、12、8、4頭仔豬,從前腔靜脈采血10 mL,3 000 r/min離心10 min取血清,-20℃保存。采血前1天20：00停喂飼糧,使仔豬空腹12 h。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

在試驗第5、15、21天分 3次進行屠宰,每次屠宰每組取4頭仔豬。在屠宰前,將各組的仔豬按體重相近原則分為3個小組,隨機選取1個小組的仔豬進行屠宰。屠宰前1天20：00停喂飼糧,使仔豬空腹12 h。屠宰試驗在08：00點開始,通過前腔靜脈注射過量戊巴比妥鈉(1 mL/kg BW,戊巴比妥鈉濃度為1 g/mL)致死仔豬。分別在十二指腸和回盲結節(jié)處末端結扎,收集回腸內(nèi)容物(IC),用MEM液按IC：MEM 液為1∶2的比例稀釋IC,加入胰蛋白酶抑制劑 250μg/mL、亮抑蛋白酶肽50μg/mL,以防細胞因子等成分的降解[15],將IC-20℃保存。

1.6 測定指標與方法

血清和IC中的免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白 A(IgA)含量采用IgG&A&M試劑盒(Maker)測定,輪狀病毒抗體(RV-Ab)水平采用豬輪狀病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ADL)測定,細胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素 -6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)水平采用豬細胞因子酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ADL)測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

結果以平均值±標準誤表示,數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件的GLM的Univariate法進行互作分析,然后進行Duncan氏多重比較,以 P＜0.01(極顯著),P＜0.05(顯著)作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 抗體

2.1.1 血清IgG、IgM 、IgA 含量

由表2可知,飼糧添加10倍 NRC推薦量的25-OH-D3顯著降低了試驗第5天仔豬血清IgG含量(P=0.005)和第5、15天血清IgM(P=0.035,P=0.003)和IgA含量(P=0.008,P=0.010)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第15天仔豬血清IgG含量(P=0.040)以及第 5、15天血清 IgM(P=0.000,P=0.000)和IgA含量(P=0.002,P=0.043)。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗期內(nèi)各階段仔豬血清IgG含量均無顯著影響(P＞0.05),但對試驗第15天血清IgM(P=0.000)和IgA含量(P=0.038)有顯著影響。

表2 血清IgG、IgM和IgA含量Table 2 IgG,IgM and IgA contents in serum mg/m L

2.1.2 腸內(nèi)容物IgG、IgM、IgA含量

由表3可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D 3有提高仔豬腸內(nèi)容物IgG、IgM、IgA含量的作用,但作用不顯著(P＞0.05)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第15天仔豬腸內(nèi)容物IgG(P=0.046)、IgA 含量(P=0.042)。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗期內(nèi)各階段仔豬腸內(nèi)容物IgG、IgM、IgA含量都沒有顯著影響(P＞0.05)。

表3 腸內(nèi)容物IgG、IgM和IgA含量Table 3 IgG,IgM and IgA contents in intestinal contents mg/m L

2.1.3 血清和腸內(nèi)容物RV-Ab水平

由表4可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第5、21天仔豬血清(P=0.018,P=0.002)和腸內(nèi)容物(P=0.005,P=0.045)RV-Ab水平。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第5、15、21天仔豬血清(P=0.000,P=0.001,P=0.000)和腸內(nèi)容物(P=0.000,P=0.000,P=0.000)RV-Ab水平。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗第5、21天仔豬血清(P=0.016、P=0.001)和腸內(nèi)容物(P=0.010、P=0.009)RV-Ab水平有顯著影響。

表4 血清和腸內(nèi)容物輪狀病毒抗體水平Table 4 Rotavirus antibody level in serum and intestinal contents IU/m L

2.2 細胞因子

2.2.1 血清細胞因子水平

由表5可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第5天仔豬血清IL-4水平(P=0.001),對血清 IL-2 、IL-6、IFN-γ水平無顯著影響(P＞0.05)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第5天仔豬血清IL-2水平(P=0.009)和第15天血清IL-6水平(P=0.006),對血清IL-4、IFN-γ水平無顯著影響(P＞0.05)。25-OH-D 3與輪狀病毒的交互作用對各階段仔豬血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ水平均無顯著影響(P＞0.05)。

2.2.2 腸內(nèi)容物細胞因子水平

由表6可知,飼糧添加10倍 NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第15天仔豬腸內(nèi)容物IL-4水平(P=0.001),顯著降低了第5、15天腸內(nèi)容物IL-6水平(P=0.013,P=0.022)和第15天腸內(nèi)容物IFN-γ水平(P=0.030)。輪狀病毒攻毒顯著降低了試驗第15天仔豬腸內(nèi)容物IL-4水平(P=0.017),對腸內(nèi)容物 IL-2、IFN-γ、IL-6水平無顯著影響(P＞0.05)。25-OH-D 與輪狀病毒的交互作用對試驗期內(nèi)各階段仔豬腸內(nèi)容物IL-2、IL-6、IFN-γ水平均無顯著影響(P＞0.05),但對試驗第15天腸內(nèi)容物IL-4水平有顯著影響(P=0.047)。

表5 血清細胞因子水平Table 5 Cytokine levels in serum pg/m L

表6 腸內(nèi)容物細胞因子水平Table 6 Cytokine levels in intestinal contents pg/m L

3 討 論

3.1 飼糧添加25-OH-D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物抗體水平的影響

維生素D3主要調(diào)節(jié)細胞免疫,但對體液免疫和抗體的分泌也有很強的調(diào)節(jié)作用。Reinhardt等[13]將1α,25-二羥基維生素D3[1α,25-(OH)2-D3]作為免疫佐劑顯著提高了乳中埃希氏大腸桿菌IgG、IgM、IgA 抗體水平 。Van der Stede等[16]給仔豬肌肉注射1α,25-(OH)2-D3和人血清白蛋白,同樣使特異抗體水平升高。這些研究表明,維生素D3能提高動物抗原特異抗體水平。本試驗結果顯示,飼糧中添加2 200 IU/kg的25-OH-D3顯著提高了斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物RV-Ab水平,對腸內(nèi)容物IgG、IgM、IgA的產(chǎn)生也有促進作用,但抑制仔豬血清IgG、IgM、IgA的產(chǎn)生。本試驗中,未攻毒試驗組仔豬血清IgG、IgM、IgA含量在試驗第5天后有低于未攻毒對照組的趨勢;攻毒試驗組仔豬血清IgG、IgM、IgA含量也較攻毒對照組低,只相當于未攻毒對照組水平。上述結果表明,飼糧添加高水平25-OH-D3有降低未攻毒仔豬血清抗體的作用,這與前人的一些報道一致[17-19]。

輪狀病毒感染會提高無菌仔豬體內(nèi)抗體分泌細胞數(shù)量[20-22],從而使仔豬產(chǎn)生大量抗體來對抗病毒感染。本試驗中,攻毒同樣使斷奶仔豬血清RV-Ab水平增加。25-OH-D 3與輪狀病毒的交互作用對血清IgM、IgA含量和 RV-Ab水平有顯著影響,提示25-OH-D3在仔豬遭受輪狀病毒攻毒的強應激條件下作用更明顯。

本試驗中,25-OH-D3降低了斷奶仔豬血清總抗體水平,促進腸內(nèi)容物總抗體分泌,對仔豬體內(nèi)血清和腸內(nèi)容物總抗體表現(xiàn)出不同的作用方式,可能與本試驗采用的從胃腸道系統(tǒng)攻毒的方式有關。黏膜免疫系統(tǒng)對病原體的防御應答主要取決于抗原刺激后功能性淋巴細胞源源不斷由感應部位轉移至效應部位[23],使消除效應更為集中。本試驗中,仔豬接觸病原體和發(fā)生免疫反應的部位主要是胃腸道黏膜組織,因此,為了對抗胃腸道受到的病原攻擊,仔豬體內(nèi)包括外周血的大量淋巴細胞遷移到腸道免疫效應部位,在腸道內(nèi)產(chǎn)生強烈的免疫應答。

3.2 飼糧添加25-OH-D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物細胞因子水平的影響

IL-2、IFN-γ是 Th1型細胞因子,在 CD4+淋巴細胞參與Th1免疫反應中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。IL-4、IL-6是Th2型細胞因子,在CD4+細胞介導的Th2免疫反應中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,如促進B細胞產(chǎn)生抗體。輔助T淋巴細胞及其分泌的細胞因子之間有自我加強效應,而分別對其相對立的細胞亞型具有抑制作用[23]。眾多研究都一致發(fā)現(xiàn)維生素D3可抑制IL-2[24-26]、IFN-γ的產(chǎn)生[27-28]。維生素D3對IL-4的作用在各種報道中不盡一致,大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)維生素D3促進IL-4的產(chǎn)生[29-31],但也有研究發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2-D3抑制極化的初級鼠CD4+細胞產(chǎn)生IL-4[28]。少量研究報道維生素D3抑制IL-6的產(chǎn)生[32]。

Azevedo等[15]的研究發(fā)現(xiàn),感染輪狀病毒提高了仔豬血清和腸內(nèi)容物細胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的水平。本試驗中,輪狀病毒攻毒提高了試驗第5天仔豬血清IL-2、IFN-γ和IL-4水平,第15天血清IL-6水平以及第5天仔豬腸內(nèi)容物IL-6水平。此結果與 Azevedo等[15]的研究基本一致。本試驗結果顯示,飼糧中添加2 200 IU/kg的25-OH-D3對斷奶仔豬體內(nèi)細胞因子的影響呈經(jīng)典的作用模式：提高抗炎癥細胞因子IL-4的水平,降低促炎癥細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的水平。上述結果說明25-OH-D 3抑制仔豬Th1型免疫反應,增強Th2型免疫應答。試驗還發(fā)現(xiàn),飼糧添加高水平25-OH-D3降低仔豬腸內(nèi)容物促炎癥細胞因子的分泌比其對外周血中的促炎癥細胞因子的作用更強烈;同時,25-OH-D3還可提高抗炎癥細胞因子的分泌。

4 結 論

①飼糧添加2 200 IU/kg的25-OH-D3顯著提高了輪狀病毒攻毒斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物RV-Ab水平,對腸內(nèi)容物IgG、IgM、IgA的產(chǎn)生也有促進作用,但抑制仔豬血清IgG、IgM、IgA的產(chǎn)生。

②飼糧添加2 200 IU/kg的25-OH-D3可以降低輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物促炎癥細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌并抑制其參與的炎癥反應,促進抗炎癥細胞因子IL-4的生成并增強其參與的免疫應答,進而表現(xiàn)出提高斷奶仔豬抗病力的作用。

[1] BECKER B A,MISFELDT M L.Evaluation of the mitogen-induced prolif eration and cell surf ace differentiation antigens of lymphocytes from pigs 1 to 30 days of age[J].Journal of Animal Science,1993,71(8)：2073-2078.

[2] BLECHA F,POLLMANN D S,NICHOLS D A.Weaning pigs at an early age decreases cellular immunity[J].Journal of Animal Science,1983,56(2)：396-400.

[3] HAMMERBERG C,SCHURIG G G,OCHS D L.Immunodeficiency in young pigs[J].American Journal of Veterinary Reaseach,1989,50(6)：868-874.

[4] WILSON A D,STOKES C R,BOURNE F J.Responses of intraepithelial lymphocytes to T-cell mitogens：a comparison between murine and porcine responses[J].Immunology,1986,58(4)：621-625.

[5] STOKES C R,BAILEY M,HAVERSON K,et al.Postnatal development of intestinal immune system in piglets：implications f or the process of weaning[J].Animal Research,2004,53：325-334.

[6] CANTORNA M T,ZHU Y,FROICU M,et al.V itamin D status,1,25-dihydroxyvitamin D3,and the immune system[J].American Journal of Clinical Nutrition,2004,80(6)：1717S-1720S.

[7] BINDERUP L.Immunological properties of vitamin D analogues and metabolites[J].Biochemical Pharmacology,1992,43(9)：1885-1892.

[8] BOUILLON R,GARMYN M,VERSTUYF A,et al.Paracrine role for calcitriol in the immunesystem and skin creates new therapeutic possibilities for vitamin D analogs[J].European Journal of Endocrinology,1995,133(1)：7-16.

[9] HEWISON M.V itamin D and the immune system[J].Journal of Endocrinology,1992,132(2)：173-175.

[10] REINHARDT T A,HORST R L,GOFF J P.Calcium,phosphorus,and magnesium homeostasis in ruminants[J].Veterinary Clinics of North America：Food Animal Practice,1988,4(2)：331-350.

[11] 李德發(fā),劉煥龍,席鵬彬,等.維生素 D3對斷奶仔豬生長性能和免疫機能的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報 ,2001,6：87-94.

[12] VAN DER STEDE Y,VERFAILLIE T,COX E,et al.1alpha,25-dihydroxyvitamin D3increases IgA serum antibody responses and IgA antibody-secreting cell numbers in the Peyer's patches of pigs af ter intramuscular immunization[J].Clinical&Experimental Immunology,2004,135(3)：380-390.

[13] REINHARDT T A,STABEL J R,GOFF J P.1,25-dihydroxyvitamin D3enhances milk antibody titers to Escherichia coli J5 vaccine[J].Journal of Dairy Science,1999,82(9)：1904-1909.

[14] WARD N E.Consideration of vitamin D3absorption may be need[J].Feedstuffs,2004,14：36-37.

[15] AZEVEDO M S P,Y UAN L,POULY S,et al.Cytokine responses in gnotobiotic pigs af ter inf ection with virulent or attenuated human rotavirus[J].Journal of Virology,2006(1)：372-382.

[16] VAN DER STEDE Y,COX E,VERDONCK F,et al.Reduced f aecal excretion of F4+-E.coli by the intramuscular immunisation of suckling piglets by the addition of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3or Cp G-oligodeoxynucleotides[J].Vaccine,2003,21：1023-1032.

[17] LEMIRE J M,ADAMSJS,SAKAI R,et al.1alpha,25-dihydroxyvitamin D 3 suppresses proliferation and immunoglobulin production by normal human peripheral blood mononuclear cells[J].The Journal of Clinical Investigation,1984,74(2)：657-661.

[18] IHO S,TAKAHASHI T,KURA F,et al.The ef fect of 1,25-dihydroxyvitamin D3on in vitro immunoglobulin production in human Bcells[J].Journal of Immunology,1986,136(12)：4427-4431.

[19] LINKER-ISRAELI M,ELSTNER E,KLINENBERG J R,et al.Vitamin D(3)and its synthetic analogs inhibit the spontaneous in vitro immunoglobulin production by SLE-derived PBMC[J].Clinical Immunology,2001,99(1)：82-93.

[20] YUAN L,WARD L A,ROSEN B I,et al.Systematic and intestinal antibody-secreting cell responses and correlates of protective immunity to human rotavirus in a gnotobiotic pig model of disease[J].Journal of Virology,1996,70(5)：3075-3083.

[21] Y UAN L,KANG S Y,WARD L A,et al.Antibody-secreting cell responses and protective immunity assessed in gnotobiotic pigs inoculated orally or intramuscularly with inactivated human rotavirus[J].Journal of Virology,1998,72(1)：330-338.

[22] CHANG K O,VANDAL O H,YUAN L,et al.Antibody-secreting cell responses to rotavirus pro-teins in gnotobiotic pigs inoculated with attenuated or virulent human rotavirus[J].Journal of Clinical M icrobiology,2001,39(8)：2807-2813.

[23] 吳玉章,白云,程曉剛.基礎免疫學[M].北京：科學技術出版社,2003.

[24] TAKEUCHI A,REDDY G S,KOBAYASHI T,et al.Nuclear factor of activated T cells(NFAT)as a molecular target f or 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3-mediated effects[J].Journal of Immunology,1998,160(1)：209-218.

[25] SMITH E A,FRANKENBURG E P,GOLDSTEIN SA,et al.Ef fects of long-term administration of vitamin D3analogs to mice[J].Journal of Endocrinology,2000,165(1)：163-172.

[26] ALROY I,TOWERS T L,FREEDMAN L P.Transcriptional repression of the interleukin-2 gene by vitamin D3：direct inhibition of NFATp/AP-1 complex formation by a nuclear hormone receptor[J].Molecular and Cellular Biology,1995,15(10)：5789-5799.

[27] CIPPITELLI M,SANTONI A.Vitamin D3：atranscriptional modulator of the interferon-gamma gene[J].European Journal of Immunology,1998,28(10)：3017-3030.

[28] STAEVA-VIEIRA T P,FREEDMAN L P.1,25-dihydroxyvitamin D3inhibits IFN-gamma and IL-4 levels during in vitro polarization of primary murine CD4+T cells[J].Journal of Immunology,2002,168(3)：1181-1189.

[29] BOONSTRA A,BARRAT F J,CRAIN C,et al.1alpha,25-dihydroxyvitamin D3has a direct eff ect on naive CD4(+)T cells to enhance the development of Th2 cells[J].Journal of Immunology,2001,167(9)：4974-4980.

[30] CANTORNA M T,WOODWARD W D,HAYES C E,et al.1,25-dihydroxyvitamin D3is a positive regulator for the two anti-encephalitogenic cytokines TGF-beta1 and IL-4[J].Journal of Immunology,1998,160(11)：5314-5319.

[31] HAGESTUEN E D,ARRUDA A F,CAMPIGLIA A D.On the improvement of solid-phase extraction room-temperature phosphorimetry for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples[J].Talanta,2000,52(4)：727-737.

[32] Evans K N,Nguyen L,Chan J,et al.Effects of 25-hydroxyvitamin D3and 1,25-dihydroxyvitamin D3on cytokine production by human decidual cells[J].Biology of Reproduction,2006,75(6)：816-822.