水葫蘆沼液對青菜生長及AsA-GSH循環(huán)影響的動態(tài)研究

薛延豐,馮慧芳,石志琦,嚴(yán)少華 ,鄭建初

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全檢測研究所,江蘇南京 210094;2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,江蘇 南京 210094;3.農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點開放實驗室,江蘇 南京210094;4.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京210097;5.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,江蘇 南京210014)

水葫蘆(Eichhornia crassipes)學(xué)名鳳眼蓮,原產(chǎn)于南美洲,屬雨久花科,因在每個葉柄中部都有一個膨大似葫蘆的球狀體而得名。具有發(fā)達的水下根系。水葫蘆喜歡高溫濕潤,水葫蘆龐大的根須不斷地吸收水中的污染物,其驚人的繁殖速度造就了超強的凈化水質(zhì)的本領(lǐng)。水葫蘆的資源化利用成了人們關(guān)注的熱點,通常水葫蘆可以直接燃燒提供能源(熱能或電能)、也可作為飼料直接利用,或者發(fā)酵后作為有機肥進行利用,研究發(fā)現(xiàn),水葫蘆體內(nèi)富含氮磷鉀,其中含N 6.56%,P 0.84%,K 12.32%,Ca 4.58%,Mg 1.58%,Fe 0.671%,Mn 0.446%,C/N接近15,水葫蘆發(fā)酵液幾乎含有植物生長的所有營養(yǎng)元素[1]。還有研究發(fā)現(xiàn),水葫蘆發(fā)酵液具有促進作物生長、抗病蟲害等功效,利用生物質(zhì)厭氧發(fā)酵形成的發(fā)酵液被譽為是一種優(yōu)質(zhì)的有機肥料和廣譜性的生物農(nóng)藥,其商品化價值巨大[2]。那么水葫蘆發(fā)酵后的沼液如何進行合理利用,還沒有得到更多的研究。通過本實驗室前期研究水葫蘆沼液對青菜(Brassica rapa)種子浸種后對種子發(fā)芽參數(shù)和生理參數(shù)的影響,發(fā)現(xiàn)水葫蘆沼液可以提高其發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、生物量以及葉綠素含量[3],為進一步研究在青菜整個生長周期內(nèi)水葫蘆沼液對其生長及AsA-GSH代謝循環(huán)的影響,故本試驗選取青菜為研究對象,使用不同比例水葫蘆沼液對青菜進行處理,分別于不同處理時間進行采樣,研究其生長及AsA-GSH代謝循環(huán)中相關(guān)參數(shù)的變化,并對其進行分析,以期進一步為水葫蘆沼液浸種的可實用性提供更為全面的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試蔬菜:青菜(綠領(lǐng)矮抗1號);供試沼液取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水葫蘆發(fā)酵后產(chǎn)生的沼液,其中pH值為7.06,全N、全P、全K含量分別為0.75 g/kg,0.22 g/kg,0.15 g/kg。該試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培苗室進行,時間為2009年5-9月。

青菜種子用0.3%的H2O2消毒后,用蒸餾水洗凈,然后挑選均一、形態(tài)正常的種子置于鋪3層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑15 cm)中,進行培苗,晝夜平均溫度分別為31和22℃。當(dāng)幼苗長到5 cm左右時,選取長勢一致的材料將其轉(zhuǎn)移至塑料盆缽中,苗齡20 d后,分別用不同處理液進行澆灌,每個處理重復(fù)3次。處理液每隔5 d澆灌一次,分別于處理15,30,45,60 d后進行采樣,測定各處理青菜相關(guān)生理生化指標(biāo)。

具體處理如下:對照(CK)、25%沼液+75%化肥(Z-25%)、50%沼液+50%化肥(Z-50%)、75%沼液+25%化肥(Z-75%)、100%沼液(Z-100%)。所用化肥采用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供的水溶性肥料,內(nèi)含全氮30%,其中銨態(tài)氮(NH4-N)2.42%、硝態(tài)氮(NO3-N)3.32%,水溶性磷(P2O5)10%,水溶性鉀(K2O)10%,水溶性鎂(MgO)0.20%及微量元素等;水葫蘆的折算方法是用水葫蘆沼液干物質(zhì)量按比例來替代化肥。

1.2 測定方法

1.2.1 鮮重測定 試驗結(jié)束后,于采樣當(dāng)天的7:00-8:00,每盆隨機挑取6棵生長狀況較一致的幼苗,然后用去離子水洗凈吸干后測量其鮮重[4,5]。

1.2.2 抗壞血酸含量測定 還原型抗壞血酸(ascorbate,AsA)、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate,DHA)和總Vc含量參照Zhang和Kirkham[6]的方法測定。稱取1 g青菜葉片在4℃下于5%的偏磷酸中研磨成勻漿,然后于4℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清液用于測定總Vc和AsA的含量。測定總Vc時,取0.3 mL上清液,加入0.75 mL含5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)的磷酸緩沖液(150 mmol/L,pH 7.4)和0.15 mL 10 mmol/L的二硫蘇糖醇(DiThioThreitol,DT T)。室溫下放置10 min后,加入0.15 mL 0.5%N-乙基馬來酰亞胺以消除多余的DT T。然后加入 0.6 mL的10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6 mL的4%雙吡啶酒精(70%)溶液和 0.15 mL的0.3%(w/v)FeCl3溶液?；靹蚝?0℃水浴40 min,測525 nm處的吸光值。AsA的測定過程中以0.3 mL水代替DT T和N-乙基馬來酰亞胺,其余操作步驟如上所述。DHA為總Vc與AsA的差值[7]。

1.2.3 谷胱甘肽含量的測定 氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量測定參照樊懷福等[8]的方法。

1.2.4 谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)測定 提取GR酶液:取0.5 g青菜,加入5 mL 50 mmol/L的T ris-HCl(pH 7.0),內(nèi)含 20%(v/v)甘油、1 mmol/L 抗壞血酸 、1 mmol/L DT T 、1 mmol/L EDTA 、1 mmol/L GSH 及5 mmol/L MgCl2,在冰上研磨后,提取液在 4℃下、10 000 r/min離心30 min,上清液用于測定酶活性[9]。GR的測定參照郭麗紅等[9]和吳錦程等[10]的方法,這是基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化后在340 nm處的吸光度減少來衡量酶活性大小的方法。反應(yīng)液包括50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液、5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L GSSG 和0.2 mmol/L NADPH,終體積為1.2 mL。在25℃下,加入GSSG啟動反應(yīng)。

1.2.5 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)相關(guān)酶活性的測定 抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性參照吳錦程等[10,11]的方法測定。取2 g葉片,加10 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液[pH 7.0,含1 mmol/L抗壞血酸,1 mmol/L EDTA、2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.25%T ritonX-100]研磨,于4℃下8 000 r/min離心20 min,上清液即為酶液。取上清液0.12 mL,加入3 mL含2.88 mL磷酸緩沖液(pH 7.0,0.5 mmol/L抗壞血酸)的反應(yīng)液,以不加酶液為對照,記錄OD290變化[10]。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)的活性測定參照吳錦程等[10,11]的方法進行,粗酶液提取方法同上,以每min內(nèi)吸光值變化0.01為一個酶活性單位(U)。

1.3 統(tǒng)計分析

運用EXCEL和SPSS生物統(tǒng)計軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液對青菜生長的影響

在不同比例沼液處理下,青菜的株高和生物量隨著處理時間的不同而不同(表1)。就株高而言,Z-25%處理下,15,30,45和60 d時,株高分別比對照增加了6.6%,6.0%,11.2%和10.5%,均顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小0.5%,但與對照差異不顯著,30 d時比對照增加了3.0%,與對照差異不顯著。隨著處理時間的增加,株高與對照相比顯著增加,45和60 d時的株高分別比對照增加了6.8%和9.9%;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時株高分別比對照減少了10.8%,17.6%,18.3%和9.9%,均顯著小于對照;隨著沼液使用比例的增加,株高生長受到嚴(yán)重影響,在Z-100%處理下,株高的變化趨勢與Z-75%處理相同,隨著處理時間的增加,株高與對照相比顯著降低。

生物量的變化趨勢與株高不同。在Z-25%處理下,15 d時鮮重增加的最多,比對照增加了22.9%,顯著大于對照,30,45和60 d時鮮重分別比對照增加了7.6%,8.7%和9.3%,均顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小1.5%,但與對照差異不顯著,30和45 d時鮮重分別比對照增加了1.0%和3.3%,60 d時比對照小14.8%,顯著小于對照;在Z-75%處理下,隨著處理時間的增加,鮮重降低的幅度越大,15,30,45和60 d時鮮重分別比對照減少了18.3%,27.3%,29.7%和42.6%,均顯著小于對照;在Z-100%處理下,鮮重的變化趨勢與Z-75%處理相同。說明用適量的水葫蘆沼液對青菜進行處理,有助于植株的生長。

表1 不同比例沼液處理對青菜生長及生物量的影響Table 1 Effects of different biogas slurry ratio on the growth and biomass in B.rapa

2.2 沼液對青菜體內(nèi)抗壞血酸含量的影響

總量Vc、AsA和DHA變化趨勢不相同(表2)。對于總量Vc而言,Z-25%處理下,15和30 d時青菜體內(nèi)總量Vc分別比對照增加了4.7%和5.0%,但與對照相比差異不顯著,隨著處理時間的增加,在45和60 d時,青菜體內(nèi)總量Vc分別比對照增加了5.2%和12.4%,顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小7.5%,顯著小于對照,30,45和60 d時分別比對照增加了1.9%,2.1%和5.7%,但與對照差異不顯著;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時青菜體內(nèi)總量Vc分別比對照減少了24.7%,20.1%,21.1%和16.1%,均顯著小于對照;在Z-100%處理下,總量Vc的變化趨勢與Z-75%處理相似,隨著處理時間的增加,總量Vc與對照相比顯著降低。

在Z-25%處理下,除了30 d時青菜體內(nèi)AsA含量顯著大于對照,處理15,45和60 d時青菜體內(nèi)AsA含量雖然與對照相比有所增加,但差異不顯著;在Z-50%處理下,15和30 d時青菜體內(nèi)AsA含量分別比對照小11.4%和3.0%,與對照差異顯著,處理45和60 d時AsA含量分別比對照小4.5%和4.8%,但差異不顯著;Z-75%處理下,青菜體內(nèi)AsA含量的變化趨勢與Z-50%處理相似;在Z-100%處理下,15,30,45和60 d時青菜體內(nèi)AsA含量分別比對照減少了61.2%,32.1%,38.1%和34.6%,均顯著小于對照。

DHA含量的變化趨勢與總量Vc和AsA含量的變化趨勢各不相同。在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,青菜體內(nèi)DHA含量分別比對照增加了5.5%,4.2%,5.5%和17.1%,均顯著大于對照;Z-50%處理下青菜體內(nèi)DHA含量的變化趨勢與Z-25%處理相似;在Z-75%處理下,處理15 d時青菜體內(nèi)DHA含量比對照小7.6%,但與對照差異不顯著,隨著處理時間的增加,在30,45和60 d時分別比對照小29.8%,27.2%和22.6%,差異顯著;在Z-100%處理下,青菜體內(nèi)的DHA含量均顯著小于對照。

表2 不同比例沼液處理對青菜體內(nèi)抗壞血酸含量的影響Table 2 Effects of different biogas slurry ratio on the ascorbate content of B.rapa

2.3 沼液對青菜幼苗葉片抗壞血酸循環(huán)中酶活性的影響

Z-25%處理下,APX酶活性隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢(圖1),處理15 d時,青菜體內(nèi)APX酶活性比對照高11.9%,顯著大于對照,30,45和60 d時,APX酶活性分別比對照高64.9%,44.5%和44.4%;在Z-50%處理下,處理15 d時,APX酶活性比對照小20.4%,顯著小于對照,處理30和45 d時,APX酶活性分別比對照高8.9%和1.8%,60 d時,比對照小4.5%,但30,45和60 d時的APX酶活性與對照差異均不顯著;在Z-75%處理下,除了處理30 d時,APX酶活性比對照高2.6%,15,45和60 d時,青菜體內(nèi)APX酶活性分別比對照減少了23.0%,19.5%和18.6%,差異顯著;在Z-100%處理下,青菜體內(nèi)APX酶活性隨著處理時間的增加,與對照相比均顯著降低。

AAO酶活性的變化趨勢與APX酶活性的變化趨勢不同(圖1)。在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,體內(nèi)AAO酶活性分別比對照高4.8%,5.9%,3.7%和7.2%,差異均不顯著;在Z-50%處理下,隨著處理時間的增加,AAO酶活性比對照的降低幅度增加,處理15,30,45和60 d時體內(nèi)AAO酶活性分別比對照低10.3%,22.0%,22.1%和24.7%,差異顯著;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內(nèi)AAO酶活性的變化趨勢與Z-50%處理相似。

在Z-25%處理下,處理15 d時,DHAR酶活性比對照高0.7%,差異不顯著,隨著處理時間的增加,DHAR酶活性顯著增加,分別比對照高14.8%,18.5%和33.7%;在Z-50%處理下,處理15 d時DHAR酶活性比對照小24.7%,顯著小于對照,處理30,45和60 d時的DHAR酶活性分別比對照小9.7%,3.7%和2.2%,但差異不顯著;在Z-75%處理下,隨著處理時間的增加,DHAR酶活性顯著降低,但降低幅度減少,處理15,30,45和60 d時,體內(nèi)DHAR酶活性分別比對照降低了57.0%,41.8%,34.1%和26.7%;Z-100%處理下青菜體內(nèi)DHAR酶活性的變化趨勢與Z-75%處理下相似(圖1)。

在Z-25%處理下,處理15 d時,MDHAR酶活性比對照小7.2%,但差異不顯著,處理30和45 d時,MDHAR酶活性分別比對照高6.2%和9.1%,差異不顯著,60 d時的MDHAR酶活性顯著大于對照;在Z-50%處理下,隨著處理時間的增加,MDHAR酶活性顯著降低,15,30,45和60 d時的MDHAR酶活性分別比對照小23.6%,30.3%,23.9%和27.5%;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內(nèi)MDHAR酶活性的變化趨勢與Z-50%處理相似(圖1)。

圖1 不同比例沼液處理對青菜體內(nèi)APX、AAO、DHAR和MDHAR的影響Fig.1 Effects of different biogas slurry ratio on the activities of APX,AAO,DHAR and MDHAR in B.rapa

2.4 沼液對青菜幼苗葉片谷胱甘肽循環(huán)的影響

在Z-25%處理下,GSSG含量隨著處理時間增加而增加(圖2),處理15,30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照增加13.5%,13.6%,12.2%和10.6%,且差異顯著;在Z-50%處理下,處理15,30和45 d時,GSSG含量分別比對照小6.0%,7.7%和7.4%,差異不顯著,處理60 d時,GSSG含量與對照相比顯著降低;在Z-75%處理下,處理15 d時,GSSG含量比對照小8.2%,差異不顯著,處理30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照減少11.9%,13.9%和14.0%,差異顯著;在Z-100%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照小15.6%,20.0%,22.1%和21.6%,且差異顯著。

在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSH含量分別比對照高5.8%,2.0%,2.1%和2.1%,但差異不顯著;在Z-50%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSH含量分別比對照小13.0%,17.5%,17.1%和17.6%,差異顯著;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內(nèi)GSH含量的變化趨勢與Z-50%處理相似,隨著處理時間的增加GSG含量顯著降低(圖2)。

圖2 不同比例沼液處理對青菜體內(nèi)GSSG和GSH含量及GR活性的影響Fig.2 Effects of different biogas slurry ratio on GSSG content,GSH content and GR of B.rapa

GR酶活性的變化與GSSG含量和GSH含量變化趨勢不同。在Z-25%處理下,處理15和30 d時,GR酶活性分別比對照高5.4%和4.9%,與對照差異不顯著,45 d時,GR酶活性比對照高26.3%,顯著大于對照,60 d時的GR酶活性與對照相同(圖2);在Z-50%處理下,15,30和 45 d時,GR酶活性分別比對照小12.4%,10.3%和16.7%,差異不顯著,60 d時的GR酶活性雖然有所降低,但與對照差異不顯著;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時,GR酶活性分別比對照小32.6%,32.0%,8.5%和16.1%,差異顯著;Z-100%處理下GR酶活性的變化趨勢與Z-75%處理相似。

3 討論

作物的正常生長需要外部提供營養(yǎng),本試驗結(jié)果表明,使用不同比例沼液代替化肥對青菜的株高及生物量產(chǎn)生不同的影響,其中以25%沼液替代化肥的處理效果最好,在不同的采樣時期,其株高和生物量均顯著大于對照,當(dāng)沼液使用比例大于50%時,株高和生物量均隨著沼液使用比例的增加而降低,與對照差異顯著。沼液能促進青菜產(chǎn)量提高,是因為沼液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[12],這些活性物質(zhì)易于被作物吸收,向作物提供營養(yǎng)。同時這些物質(zhì)還可以促進植物根系發(fā)育,增加植株對營養(yǎng)的吸收,促進植株的生長,同時增加植物的抗病能力,提高產(chǎn)量[13,14],根系活力泛指根系整個代謝的強弱,包括吸收、合成、呼吸作用和氧化力等,能客觀地反映根系生命活動,根系活力的大小與整個植株生命活動的強度緊密相關(guān)[15]。而高量沼液處理使得其生長和產(chǎn)量降低。這些與前人研究結(jié)果相同[16-18]。

在正常情況下,植物體內(nèi)清除活性氧的酶類活性較強,可及時清除植物受環(huán)境脅迫時產(chǎn)生的過量活性氧,從而使活性氧的產(chǎn)生和清除保持一種動態(tài)平衡[4,19]。AsA、DHA、APX、AAO、DHAR、MDHAR和GSSG、GSH、GR組成了AsA-GSH循環(huán),其中APX、MDHAR、DHAR和GR是AsA-GSH循環(huán)活性氧清除系統(tǒng)的重要酶組成,AsA和GSH等是重要的非酶抗氧化物質(zhì)。在AsA-GSH循環(huán)中,GSH,AsA和MDHAR、DHAR,APX,AAO和GR等組成植物葉綠體 AsA-GSH循環(huán)中的抗氧化防御系統(tǒng),在清除活性氧方面起重要作用[10,20]。其中,APX和AAO是植物的2種抗壞血酸氧化酶,MDHAR和DHAR在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中AsA的再生起到了很重要的作用,是植物的2種抗壞血酸還原酶[21]。試驗結(jié)果表明,用25%沼液替代化肥處理下的45和60 d,總量Vc與對照相比顯著增加,AsA雖然有所增加(除了30 d時),但與對照差異不顯著,DHA含量均顯著大于對照,當(dāng)沼液使用比例大于50%時,總量Vc、AsA和DHA與對照相比均顯著降低;在AsA循環(huán)中的APX、AAO和DHAR活性變化趨勢相似,均隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢,其中以25%沼液替代化肥處理下30 d酶活性最高,而MDHAR活性則隨著處理時間的增加而增加,以25%沼液替代化肥的處理效果最好;在GSH循環(huán)中的GSSG和GSH含量隨著處理時間的增加而增加,以25%沼液替代化肥的處理效果最好,與對照差異顯著,而GR活性隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢,其中以25%沼液替代化肥處理下45 d酶活性最高。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在25%沼液處理下,可有效增加AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)酶活性和相關(guān)物質(zhì)含量,從而促進了AsA-GSH循環(huán),間接地增加了青菜體內(nèi)Vc含量,改善了青菜的品質(zhì),這與Jin等[22]的研究結(jié)果一致。

通過本試驗結(jié)果,同時結(jié)合前期研究[3],發(fā)現(xiàn)適宜濃度的水葫蘆沼液浸種不僅可以促進種子發(fā)芽,提高發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、生物量以及葉綠素含量,而且適宜比例的水葫蘆沼液處理,還可以促進植株的生長,增加了體內(nèi)AsA-GSH代謝循環(huán),提高了青菜的抗氧化防御能力。

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