瘋草及毒性成分研究進(jìn)展

高新磊,韓冰,趙萌莉 ,何江峰,于婷

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018)

瘋草(locoweed)指含苦馬豆素(swainsonine,SW)的豆科多年生草本黃芪屬(Astragalus)和棘豆屬(Oxytropis)有毒植物[1,2],家畜采食一定量的瘋草后,就會(huì)表現(xiàn)出中毒癥狀,嚴(yán)重的導(dǎo)致家畜死亡。瘋草引發(fā)的家畜中毒癥狀,國(guó)際上將其稱為瘋草病(locoism)[3]。瘋草的分布比較廣泛,屬于世界性毒草,也是目前對(duì)畜牧業(yè)危害最大的有毒植物之一。關(guān)于家畜瘋草中毒最早見(jiàn)于1873年美國(guó)加州南部家畜瘋草中毒的報(bào)道[4],國(guó)內(nèi)的有關(guān)報(bào)道較晚,在1954年,任繼周[5]報(bào)道了硬毛棘豆(Oxytropis hirta)和有毒黃芪能引起家畜中毒,這是國(guó)內(nèi)最早的有關(guān)家畜瘋草中毒的報(bào)道,在這以后國(guó)內(nèi)外有關(guān)瘋草中毒的報(bào)道日益增多,人們從此開(kāi)始關(guān)注瘋草,并不斷對(duì)其毒性成分進(jìn)行研究。1979年,Colegate等[6]首次從灰苦馬豆(Swainsona canescens)中分離出吲哚茲定生物堿苦馬豆素,并確定其為瘋草的主要毒性成分,從此揭開(kāi)瘋草毒性成分研究的新篇章。到目前為止,人們從瘋草中分離苦馬豆素的工作仍在繼續(xù),而對(duì)苦馬豆素的毒性機(jī)理已有了較深入的了解。研究表明,苦馬豆素能夠可逆抑制溶酶體α-甘露糖甘酶I和抑制高爾基體α-甘露糖苷酶II,前者是導(dǎo)致家畜中毒原因,后者是其具有抗腫瘤作用的原因。瘋草主要毒性成分確定之后,人們一直對(duì)瘋草的產(chǎn)毒機(jī)制進(jìn)行研究。1999年,Braun[7]首次從絹毛棘豆(O.sericea)分離出內(nèi)生真菌,并確定該菌能夠產(chǎn)生苦馬豆素,可能與瘋草的毒性有關(guān)。2004年,McLainRomero等[8]首次培育出了無(wú)內(nèi)生真菌的斑莢黃芪(Astragalus lentiginosus)植株,并確定植株中不含有苦馬豆素,由此證明苦馬豆素是由瘋草內(nèi)生真菌產(chǎn)生的。在國(guó)內(nèi),1989年,曹光榮等[9]首次從黃花棘豆(O.ochrantha)中分離出苦馬豆素,而對(duì)于瘋草內(nèi)生真菌的分離是自2006年Wang等[10]從甘肅棘豆(O.kansuensis)中分離出內(nèi)生真菌開(kāi)始,2009年1月,盧萍等[11]從內(nèi)蒙古小花棘豆(O.glabra)中分離出了內(nèi)生真菌,同年10月,余永濤等[12]從西藏毛瓣棘豆(O.sericopetala)、冰川棘豆(O.glacialis)、莖直黃芪(A.strictus)中分離出了產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)瘋草的研究主要集中在內(nèi)生真菌的分離鑒定以及內(nèi)生真菌與苦馬豆素之間的關(guān)系方面。本研究主要對(duì)瘋草的分布、危害、防治進(jìn)行總結(jié),對(duì)其毒性成分的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)瘋草研究中產(chǎn)生的一些問(wèn)題進(jìn)行了討論,以期望相關(guān)研究者們能更深入的去研究瘋草,更好的利用瘋草。

1 瘋草的分布、影響及防治

1.1 瘋草的分布情況

在我國(guó),瘋草主要分布在西北、西南、華北地區(qū),如內(nèi)蒙古、寧夏、青海、甘肅、陜西、云南、西藏、新疆等省區(qū)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前,我國(guó)瘋草面積已經(jīng)超過(guò)1 100萬(wàn)hm2,約占全國(guó)草場(chǎng)面積的2.8%,而且每年都有增加的趨勢(shì)[13]。我國(guó)瘋草有45種,其中棘豆屬23種、黃芪屬22種[14],其中危害較大的瘋草包括:棘豆屬的黃花棘豆、甘肅棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆和冰川棘豆;黃芪屬的莖直黃芪和變異黃芪(A.variabilis)[15]。

在國(guó)外,瘋草主要分布于北美的美國(guó)、加拿大、墨西哥;歐洲的俄羅斯、西班牙和冰島及北非的摩洛哥和埃及等國(guó),其中以美國(guó)西部瘋草危害最為嚴(yán)重[16],瘋草危害較嚴(yán)重的種類包括:藍(lán)伯氏棘豆(O.lambertii)、絹毛棘豆、密柔毛黃芪(A.mollissimus)、斑莢黃芪等[17]。目前,由于環(huán)境物候的改變,許多瘋草種群的變化很大,某些瘋草的詳細(xì)分布地區(qū)需要重新進(jìn)行調(diào)查。

1.2 瘋草的主要危害

瘋草的主要危害是引起家畜瘋草中毒導(dǎo)致瘋草病。瘋草中毒是一個(gè)慢性過(guò)程,普遍以神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂為主,如走路蹣跚搖晃、缺乏肌肉協(xié)調(diào)性、進(jìn)食困難、精神沉郁,頭部震顫,反應(yīng)遲鈍,母畜流產(chǎn),公畜不育[16,18,19]。在病理上的變化更為復(fù)雜,但最普遍的組織學(xué)變化是神經(jīng)元、肝腎一些細(xì)胞的空泡化變性[16,20]?；诏偛葜卸镜陌Y狀,瘋草造成損失的最直接危害是導(dǎo)致家畜中毒死亡及家畜繁殖效率的下降,最終給人們?cè)斐芍卮蟮慕?jīng)濟(jì)損失,阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展。

此外,瘋草是草地植被成員之一,已經(jīng)進(jìn)化出了對(duì)草地環(huán)境相對(duì)較好的適應(yīng)性。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展,人們對(duì)草地自然資源的利用大大增加,對(duì)草原利用不當(dāng)致使某些地區(qū)的草場(chǎng)可利用牧草數(shù)量下降,結(jié)果瘋草等有毒植物有機(jī)可乘,迅速蔓延,有的草原上已經(jīng)形成建群種,加之瘋草等有毒植物的抗逆性相對(duì)較強(qiáng),會(huì)與優(yōu)良牧草產(chǎn)生激烈的生存競(jìng)爭(zhēng),造成優(yōu)良牧草的產(chǎn)量、質(zhì)量下降。瘋草的蔓延破壞了草地的生態(tài)平衡,減少了草地植被的生物多樣性,同時(shí),還加速了草場(chǎng)的退化,阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1.3 瘋草的防治

瘋草的防治主要包括短期性防治和長(zhǎng)期性防治。短期性防治,是指在瘋草發(fā)生時(shí)或是家畜瘋草中毒后所采用的即時(shí)解決方法,對(duì)瘋草的防治常能起到立竿見(jiàn)影的效果,但是對(duì)瘋草防治具有不徹底性。目前,短期性防治所用的方法多為物理和化學(xué)方法。物理方法主要包括人工挖除和焚燒等方法,此法在小面積的瘋草集中發(fā)生地能起到一定的除草效果,但是需要投入大量的人力、物力,同時(shí)還可能破壞草地植被。化學(xué)方法主要是利用化學(xué)藥劑除瘋草,此法的除草效率較高,且除草速度較快,在瘋草大發(fā)生時(shí)可能起到很好的效果,但仍有缺陷。目前,尚沒(méi)有針對(duì)瘋草的特異除草劑,除草劑對(duì)其他可食牧草也有毒殺作用,還可能引起環(huán)境污染。瘋草的種子和根系埋在土壤中,是上述方法所不能根除的,短期性防治過(guò)后,瘋草仍會(huì)再生[21]。

對(duì)于已經(jīng)表現(xiàn)出瘋草中毒癥狀的家畜,可以通過(guò)停止家畜進(jìn)食瘋草的方法來(lái)緩解,還可以通過(guò)一些藥物對(duì)家畜進(jìn)行解毒,目前,對(duì)于解毒藥物的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。最初,對(duì)小花棘豆中毒,一般采取灌酸奶、食醋以及硫代硫酸鈉等滲葡萄糖溶液等方法解毒。趙巧娥等[22]用醋糟與黑面混合對(duì)小花棘豆中毒山羊解毒;常建軍等[23]報(bào)道“瘋草靈解毒緩釋丸”可有效地預(yù)防綿羊棘豆中毒,能推遲中毒癥狀出現(xiàn)的時(shí)間,但還不能預(yù)防對(duì)肝臟、腎臟和肌肉等組織器官的損傷。

瘋草的長(zhǎng)期性防治,是指從生態(tài)學(xué)的角度考慮,在不破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡的前提下,減輕或消除瘋草毒性成分對(duì)家畜的毒害,從而達(dá)到對(duì)草地資源的可再生性利用以及畜牧業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展的目的,對(duì)于家畜多是以預(yù)防為主。長(zhǎng)期性防治,一般需要經(jīng)過(guò)一段漫長(zhǎng)的防治周期。針對(duì)瘋草,主要采取調(diào)整草場(chǎng)結(jié)構(gòu),控制瘋草生長(zhǎng)的方法,篩選出對(duì)瘋草有強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性的牧草種,在瘋草多發(fā)區(qū)進(jìn)行播種,最終降低了瘋草種群的數(shù)量,降低了家畜中毒的危險(xiǎn)性[21,24]。針對(duì)家畜,近些年已經(jīng)發(fā)展出了較新的方法(免疫法)來(lái)預(yù)防家畜中毒。童德文等[25]將苦馬豆素與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶聯(lián),可以誘導(dǎo)出產(chǎn)生苦馬豆素的抗體。在國(guó)外,James[26]曾利用Cu、Ca、P、Se、賴氨酸、維生素 E、復(fù)合維生素B、吡哆醇和甲狀腺制劑飼喂牛羊預(yù)防瘋草中毒,但未成功。目前,已經(jīng)分離和培養(yǎng)了苦馬豆素降解菌株,有望將其解毒基因轉(zhuǎn)移給家畜的瘤胃微生物,以增加家畜的免疫力[14]。

2 瘋草毒性相關(guān)研究

2.1 瘋草毒性成分研究

對(duì)有毒植物毒性成分的研究經(jīng)歷了一段比較曲折的過(guò)程,最初,人們認(rèn)為引起人和家畜中毒的有毒成分是植物的最終代謝物,對(duì)植物本身沒(méi)有任何作用,隨著研究的深入才發(fā)現(xiàn),某些有毒植物的毒性成分與植物的次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。

在國(guó)外,棘豆屬和黃芪屬有毒植物的主要有毒成分可歸納為3類,即脂肪族硝基化合物、硒化合物和生物堿[27],而瘋草的主要有毒成分已經(jīng)被確定為一種生物堿-苦馬豆素[28]。

2.1.1 脂肪族硝基化合物毒性機(jī)理 目前,已經(jīng)確定含脂肪族硝基化合物毒素的有毒植物基本上都屬于黃芪屬有毒植物。Stermitz[29]從矩圓葉黃芪(A.miser var.oblongitotices)中分離出硝基化合物,稱為米瑟毒甙(miserotoxin),化學(xué)名稱為3-硝基-1-丙醇-β-D 吡喃葡萄糖甙(3-nitro-l-propyL-β-D-glucopyransside),在消化道里可被分解為毒性高的3-硝基-1-丙醇(3-nitro-1-propanol,3NPOH),在 1977-1981年,Williams[30]對(duì)世界上1 690余種黃芪進(jìn)行了化學(xué)分類研究,發(fā)現(xiàn)263種黃芪含有脂肪族硝基化合物。在國(guó)內(nèi),曹光榮等[31]對(duì)黃花棘豆、甘肅棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆等進(jìn)行分析,確定其中不含脂肪族硝基化合物。

有關(guān)中毒機(jī)理研究認(rèn)為,3NPOH在動(dòng)物體內(nèi)的代謝物3-硝基-1-丙酸(3-nitro-1-propionic acid,3-NPA)能抑制三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶和延胡索酸酶,阻斷三羧酸循環(huán)從而引起動(dòng)物中毒。3-NPA還可以進(jìn)一步代謝為亞硝酸鹽,引起動(dòng)物的高鐵血紅蛋白血癥。因此,家畜采食植物可引起急性或慢性中毒[27,32]。但是,此毒素引起的中毒癥狀與瘋草中毒不同,所以可以確定脂肪族硝基化合物毒素不可能是瘋草毒性成分,同時(shí),含脂肪族硝基化合物毒素的黃芪屬有毒植物也不應(yīng)該歸為瘋草一類。

我國(guó)有17種含脂肪族硝基化合物毒素的黃芪屬有毒植物,但未引起大范圍的家畜中毒事件,但是在北美的黃芪屬植物50%含脂肪族硝基化合物[31,33],可想而知,其家畜中毒幾率比較大,Marsh[34]就報(bào)道了關(guān)于牛、羊四翹黃芪(A.latraperus)的中毒事件。

2.1.2 硒化合物毒性機(jī)理 某些黃芪屬植物在發(fā)育時(shí)需要硒,并且具有強(qiáng)的聚硒能力,而關(guān)于棘豆屬植物的聚硒作用,在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。硒在植物體內(nèi)以含硫氨基酸的類似物形式存在,因此硒會(huì)與體內(nèi)的含硫化合物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng),從而干擾正常的細(xì)胞代謝,有人認(rèn)為,硒濃度過(guò)高超過(guò)了機(jī)體解毒的最高負(fù)荷,最終導(dǎo)致家畜中毒[27,32]。此類毒素引起的中毒癥狀也不同于瘋草中毒,因此,此類毒素也不是瘋草毒性成分,聚硒黃芪植物也不應(yīng)該歸為瘋草一類。

據(jù)調(diào)查,我國(guó)湖北恩施和陜西柴陽(yáng)地區(qū)屬高硒地區(qū),而有毒黃芪中毒一般都發(fā)生在缺硒地區(qū),最初,國(guó)內(nèi)學(xué)者們進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究,但是最終確定我國(guó)黃芪屬植物中毒與硒無(wú)關(guān)[14]。在北美,很多地區(qū)土壤中都富含硒。據(jù)報(bào)道,美國(guó)約有24種聚硒黃芪,家畜食用后都會(huì)引起中毒[35]。

2.1.3 生物堿毒性機(jī)理 Couch[36]從藍(lán)伯氏棘豆中分離出瘋草毒素,可引起貓的瘋草病,但未能鑒定其結(jié)構(gòu)。Fraps[37]從密柔毛黃芪中分離出一種有毒成分,取名洛柯因(locoin),洛柯因及其衍生物醋酸鹽、酒石酸鹽和檸檬酸鹽都可引起瘋草中毒癥狀,但當(dāng)時(shí)未能確定其為生物堿。直到1979年,Colegate等[6]首次從灰苦馬豆中分離出吲哚茲定生物堿苦馬豆素。1982年,Molyneux和James[28]從斑莢黃芪中也分離出苦馬豆素,證明苦馬豆素為瘋草的主要毒性成分。在國(guó)內(nèi),1989年,曹光榮等[9]首次從黃花棘豆中分離出苦馬豆素;2001年,童德文等[38]從甘肅棘豆中分離得到苦馬豆素。2002年,譚遠(yuǎn)友等[39]也分析了西藏冰川棘豆的毒性成分為生物堿。至此,瘋草中主要有毒成分為苦馬豆素已有充分研究依據(jù)。

苦馬豆素因最早從灰苦馬豆分離出來(lái)而得名,其分子式為C8H15O3N,相對(duì)分子質(zhì)量為173,熔點(diǎn)144～145℃,純品為白色針狀晶體,酸解離常數(shù)為7.4?？囫R豆素屬于吲哚茲定生物堿(indolizidine alkaloid),吲哚茲定環(huán)的1,2,8位上各帶有一個(gè)羥基,故被命名為1,2,8-三羥基八氫吲哚茲定(1,2,8-trihydroxyoctahydroindolizidine)。也可被命名為吲哚茲定三醇(8α β-indolizidine-1α,2α,8β-triol)[40],苦馬豆素的性質(zhì)比較穩(wěn)定,據(jù) Molyneux等[41]報(bào)道,在植物體內(nèi),保存15年的斑莢黃芪仍含有苦馬豆素。

在毒理方面,苦馬豆素主要通過(guò)抑制溶酶體α-甘露糖甘酶I活性引起細(xì)胞功能紊亂,尤其是神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂,而使家畜表現(xiàn)出一系列神經(jīng)癥狀,即為瘋草中毒癥狀。苦馬豆素對(duì)溶酶體中α-甘露糖苷酶I產(chǎn)生極大抑制作用,從而造成甘露糖積累,使糖蛋白合成受阻,結(jié)果溶酶體內(nèi)大量低聚糖聚集,導(dǎo)致細(xì)胞特別是神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,使家畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)器官的主質(zhì)細(xì)胞受到損害。苦馬豆素對(duì)α-甘露糖苷酶I的抑制是可逆的,只有苦馬豆素達(dá)到一定劑量后,才能表現(xiàn)出中毒癥狀,家畜停止進(jìn)食瘋草后,細(xì)胞修復(fù)很快開(kāi)始,但是可能導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能紊亂[42]。

在藥理方面,苦馬豆素主要具有抗腫瘤和增加機(jī)體免疫力的作用。由于苦馬豆素還能抑制高爾基體α-甘露糖苷酶II,此酶用來(lái)合成糖蛋白中N-連接的寡糖(N-linked oligosaccharide),而N-連接的寡糖多見(jiàn)于膜或分泌糖蛋白,這些蛋白對(duì)惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移十分重要,因此,苦馬豆素可能通過(guò)抑制高爾基體α-甘露糖苷酶II而最終抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[42,43]。研究表明,苦馬豆素有免疫刺激作用,它能增強(qiáng)NK細(xì)胞(natural killer cell)和組織特異性巨噬細(xì)胞(tissue-specific macrophage)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的合成和分泌;提高IaK-特異性抗原和H LA1類特異性抗原的表達(dá),活化蛋白激酶C,刺激B細(xì)胞的增殖[40]。

目前,已經(jīng)從一些植物和真菌分離提取出了苦馬豆素。含苦馬豆素的植物有豆科苦馬豆屬、棘豆屬、黃芪屬;錦葵科黃花稔(Sida carpini folia);旋花科番薯屬(Ipomoea)[13,14]。含苦馬豆素的真菌有豆類絲核菌[44-46]、金龜子綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)[47]、瘋草內(nèi)生真菌[48]?？囫R豆素的提取方法多用索氏提取法或者溶劑冷浸法處理干樣[13,49],然后依次經(jīng)酸水、堿水萃取和硅膠柱層析等逐步純化,最后對(duì)純化物進(jìn)行100℃減壓油浴升華。超聲波協(xié)助提取技術(shù)提高了苦馬豆素的提取效率[13,50]。對(duì)苦馬豆的定性檢測(cè)常用薄層色譜法(thin layer chromatography,T LC)[51]和甘露糖苷酶免疫法[52],在此基礎(chǔ)上,Gardner等[53]發(fā)展了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)定量測(cè)定苦馬豆素含量的方法,檢測(cè)限量為0.001%,含量接近這個(gè)極限后,還可以用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS)進(jìn)一步檢測(cè)。目前,國(guó)內(nèi)采用的苦馬豆素定量分析方法主要有薄層色譜掃描法、氣相色譜法(gas chromatography,GC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[54]。最近,國(guó)內(nèi)也有人利用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)對(duì)苦馬豆素進(jìn)行分析研究[55]。此外,在苦馬豆素的人工合成方面也取得了很大進(jìn)展,早在1984年,美國(guó)Yasuda等[56]已經(jīng)人工合成了苦馬豆素,隨后Bennett III等[57]人工合成也獲得成功,加拿大Toronto化學(xué)研究所也有了合成產(chǎn)品;我國(guó)周維善[58]對(duì)苦馬豆素的人工合成也進(jìn)行了研究。

2.2 瘋草產(chǎn)毒機(jī)制研究

瘋草的毒性成分已經(jīng)確定為苦馬豆素,但是在很長(zhǎng)一段時(shí)間里,人們對(duì)瘋草的產(chǎn)毒機(jī)制一無(wú)所知,直到瘋草內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn),才初步了解瘋草的產(chǎn)毒機(jī)制與其內(nèi)生真菌有關(guān)。

植物內(nèi)生真菌是生活在植物健康組織中的一類微生物,它不引起植物生理病變,與植物是互惠互利的共生關(guān)系(如固氮根瘤菌)[59,60]。對(duì)其研究最初始于禾草中,19世紀(jì)末,人們發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生真菌的一些禾本科植物[如黑麥草(Lolium perenne)]會(huì)引起牛、羊等家畜中毒。到 20世紀(jì)末,人們才發(fā)現(xiàn)豆科瘋草中也含內(nèi)生真菌。Braun[7]在1999年首次從絹毛棘豆分離出內(nèi)生真菌,并初步鑒定為對(duì)鏈格孢屬(Alternaria),2003年從密柔毛黃芪、絹毛棘豆、藍(lán)伯氏棘豆分離出內(nèi)生真菌,根據(jù)分生孢子的形態(tài)學(xué)鑒定以及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列分析,將其確定為埃里磚格孢屬(Embellisia)內(nèi)生真菌[48,61]。

根據(jù)以前對(duì)禾草內(nèi)生真菌的研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌常存在于植物的葉片、莖、花以及種子之中[62],瘋草內(nèi)生真菌也有同樣的特性。瘋草內(nèi)生真菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)能夠產(chǎn)生苦馬豆素,最初,人們認(rèn)為苦馬豆素是植物的自身次生代謝產(chǎn)物,自從發(fā)現(xiàn)瘋草內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生苦馬豆素后,這種想法也隨之轉(zhuǎn)變。2003年,Braun等[48]發(fā)現(xiàn)從具有更高苦馬豆素含量的植物中分離出來(lái)的內(nèi)生真菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)能產(chǎn)生出更多的苦馬豆素。2004年,Gardner等[53]通過(guò)對(duì)藍(lán)伯氏棘豆16個(gè)種群的比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低水平的苦馬豆素含量與內(nèi)生真菌的缺失有關(guān),高水平的苦馬豆素含量與內(nèi)生真菌的存在有關(guān)。McLainRomero等[63]給試驗(yàn)小鼠喂食瘋草內(nèi)生真菌,結(jié)果小鼠表現(xiàn)出瘋草中毒癥狀,還發(fā)現(xiàn)在瘋草種子中,僅在種皮的糊粉層和薄壁組織層中含有內(nèi)生真菌,在這之后他們將瘋草種子去掉種皮培育出植株,經(jīng)過(guò)PCR測(cè)定表明植株中不含有內(nèi)生真菌,通過(guò)LC-MS檢測(cè)表明植株中不含有或不產(chǎn)生苦馬豆素[8]。這就充分的證明了瘋草內(nèi)生真菌是瘋草中苦馬豆素的主要來(lái)源,瘋草內(nèi)生真菌才是導(dǎo)致家畜瘋草中毒的元兇。

目前,已經(jīng)從一些瘋草中分離并培養(yǎng)出了內(nèi)生真菌。在國(guó)內(nèi),已經(jīng)從甘肅棘豆和小花棘豆中分離培養(yǎng)出了產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌,但是對(duì)瘋草內(nèi)生真菌的研究還處于起步階段,相關(guān)的研究報(bào)道還比較少。在國(guó)外,尤其是美國(guó),已經(jīng)對(duì)瘋草內(nèi)生真菌進(jìn)行了大量相關(guān)研究,2003年,Belfon和Creamer[64]通過(guò)對(duì)瘋草內(nèi)生真菌進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記分析(random amplified polymorphic DNA,RAPD),以及ITS序列分析,結(jié)果顯示,在棘豆屬瘋草中分離的埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌具有遺傳相似性,RAPD條帶相同,而且具有幾乎一致的核酸序列,而黃芪屬瘋草內(nèi)生真菌則顯示更高遺傳多樣性。2005年,Oldrup[65]通過(guò)改變一些環(huán)境因素,研究了瘋草及其內(nèi)生真菌產(chǎn)生的苦馬豆素水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低pH(5.5降至4.5)及中度水分脅迫的條件下,它們的苦馬豆素水平會(huì)升高,而N、P、K的缺乏、升高溫度不影響苦馬豆素水平;此外,Oldrup[65]研究還發(fā)現(xiàn),瘋草內(nèi)生真菌還有助于植物抵抗干旱條件。2009年,Pryor等[66]根據(jù)內(nèi)生真菌ITS序列的分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建將瘋草中的埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌重新分類為Undifilim oxytropis內(nèi)生真菌。

3 瘋草研究中存在的問(wèn)題及建議

3.1 瘋草的分類問(wèn)題

在我國(guó),豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的毒性都源于苦馬豆素,所以多數(shù)國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)中也把所有的豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物統(tǒng)稱為瘋草。瘋草一詞來(lái)源于國(guó)外,最初指的是豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物,現(xiàn)在進(jìn)一步明確含有生物堿苦馬豆素的豆科植物為瘋草。在國(guó)外,黃芪屬有毒植物的毒性不都是由生物堿苦馬豆素所致,還有一些含脂肪族硝基化合物、硒化合物等毒素,這些毒素所引起的家畜中毒癥狀與瘋草病是不同的,此類黃芪屬有毒植物不屬于瘋草。這樣會(huì)造成國(guó)內(nèi)外的分類不統(tǒng)一,會(huì)給瘋草的深入研究帶來(lái)麻煩,建議對(duì)瘋草從毒理學(xué)角度重新定義,并對(duì)其重新分類。

3.2 瘋草的研究地域問(wèn)題

目前,由于地域限制,對(duì)瘋草研究只能局限在本國(guó)某個(gè)地區(qū)內(nèi)進(jìn)行,所得出研究結(jié)果可能會(huì)有片面性,因?yàn)榀偛莸亩拘栽诤艽蟪潭壬蠒?huì)受環(huán)境因素的制約,例如,本地區(qū)的瘋草移栽到其他地區(qū),其毒性的強(qiáng)弱是否會(huì)改變,尤其在不同國(guó)家之間的地理環(huán)境差異更為顯著,瘋草在不同的自然生境下是否會(huì)產(chǎn)生不同的生理變化,繼續(xù)對(duì)這些問(wèn)題的研究會(huì)對(duì)瘋草的改良有很大的幫助。Ralphs等[67]在美國(guó)新墨西哥州采集的藍(lán)伯氏棘豆中苦馬豆素含量為0.006%,而2002年再次檢測(cè)卻未發(fā)現(xiàn)有苦馬豆素(或是低于檢測(cè)下限0.001%);Gardner等[53]檢測(cè)新墨西哥州、科羅拉多州和猶他州絹毛棘豆苦馬豆素含量分別為0.097%,0.062%和0.046%。國(guó)外最近研究表明,黃芪屬瘋草苦馬豆素含量普遍高于棘豆屬瘋草,導(dǎo)致這種差異的原因還不十分清楚。建議擴(kuò)大對(duì)某一種瘋草的研究地域,條件允許可以設(shè)計(jì)在不同國(guó)家地區(qū)間對(duì)某一種瘋草進(jìn)行系統(tǒng)研究。

3.3 瘋草的利用前景問(wèn)題

有些瘋草的蛋白含量較高(如黃花棘豆),可以對(duì)瘋草進(jìn)行去毒處理或制成飼料草粉,但此法僅限于瘋草較集中的地區(qū)適用[68]。瘋草中所含的苦馬豆素還可以用來(lái)開(kāi)發(fā)抗腫瘤新藥,而且瘋草內(nèi)生真菌能產(chǎn)生苦馬豆素,為抗腫瘤藥物的生產(chǎn)又開(kāi)辟了一條新的途徑。此外,瘋草內(nèi)生真菌在瘋草中,能增加瘋草的抗逆性(如抗旱性、抗寒性),其作用機(jī)理尚未清楚,有望通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)方法去除瘋草內(nèi)生真菌中的有害基因,使得在不減弱瘋草抗逆性及營(yíng)養(yǎng)性的情況下,得到無(wú)毒害瘋草,從而達(dá)到在根本上改良瘋草的目的。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)瘋草的生理、遺傳、生態(tài)等方面的相關(guān)研究已經(jīng)取得了一定成果,但是想徹底解決瘋草蔓延及牲畜中毒問(wèn)題,仍然有一條漫長(zhǎng)的路要走。

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