采用流式細(xì)胞儀鑒定紫花苜?；ㄋ幱鷤M織的變異

耿小麗,魏臻武 ,姚喜紅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州730070;2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225009)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生異花授粉豆科作物。自然環(huán)境下絕大多數(shù)紫花苜蓿為同源四倍體(2n=4x=32),少數(shù)為四倍體的變異體。苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)時(shí),由于小孢子在形成愈傷組織的過程中,經(jīng)歷了連續(xù)不斷的有絲分裂過程,因此,染色體水平上發(fā)生變異的可能性大大增加。這種遺傳變異具有雙重性,一方面可以利用有益變異為育種工作服務(wù),另一方面變異的不確定性又為優(yōu)良性狀的保持帶來了極大的困難[1]。因此,在育種過程中,掌握愈傷組織的遺傳變異規(guī)律就顯得尤為重要。Larkin和Scowcroft[2]指出植物組織培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)可遺傳的變異,并將組織和細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的變異稱為體細(xì)胞無性系變異。Yoshida等[3]在水稻(Oryza sativa)花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),愈傷組織繼代時(shí)間越長,變異率越高。Muller等[4]利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)分子標(biāo)記研究不同繼代時(shí)間對無性系變異的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)延長繼代時(shí)間可增加體細(xì)胞無性系DNA的多態(tài)性。不同植物染色體數(shù)目的穩(wěn)定性存在差異,谷明光[5]發(fā)現(xiàn)玉米(Zea mays)花粉愈傷組織倍性較為穩(wěn)定。

染色體計(jì)數(shù)法是植物研究中最常用的染色體檢測方法[6]。此方法雖然準(zhǔn)確性高,但操作復(fù)雜,觀察細(xì)胞群體小,難以實(shí)現(xiàn)大量材料的倍性鑒定[7,8]。本試驗(yàn)所采用的流式細(xì)胞儀可以同時(shí)對大量細(xì)胞進(jìn)行染色體檢測,提高了結(jié)果準(zhǔn)確度,并且DNA變異可在分布圖上直觀地表現(xiàn)。此外,流式細(xì)胞儀還可以快速地鑒定細(xì)胞周期。

本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀對3個(gè)基因型8個(gè)繼代周期的苜?；ㄋ幱鷤M織DNA含量進(jìn)行測定及遺傳變異分析,旨在研究苜蓿花藥愈傷組織染色體的變異現(xiàn)象,為紫花苜蓿優(yōu)良品種選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的單株,3個(gè)材料種植于甘肅省皋蘭縣試驗(yàn)基地。試驗(yàn)于2008年5月開始。

1.2 苜蓿花藥愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

在苜蓿初花期到盛花期期間,采集3個(gè)基因型紫花苜蓿單株上花藥發(fā)育處于單核中、晚期的花蕾(使用醋酸洋紅染色壓片法,觀察、確定發(fā)育時(shí)期。從外觀上選擇花冠最外面的旗瓣緊包,花冠飽滿,伸出花萼1～2mm,呈刀尖狀的花蕾)。將采集的花蕾放置在4℃的冰箱內(nèi)低溫處理12～24 h;然后將花蕾滅菌,在無菌條件下剝出花粉,接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(NB+0.5 g/L 2,4-D+0.2 g/L NAA+0.5 g/L 6-BA+2 g/L KT+9%蔗糖+0.7%瓊脂),在溫度為25℃、光強(qiáng)1 000 lx、光照時(shí)間16 h/d、濕度40%的環(huán)境下培養(yǎng)。誘導(dǎo)出愈傷組織后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基(NB+3%蔗糖+0.7%瓊脂),20 d為1個(gè)繼代周期。培養(yǎng)條件同上。

1.3 采用流式細(xì)胞儀測定苜蓿愈傷組織DNA含量

本試驗(yàn)使用德國Partec公司PA-1型流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量的檢測。每1個(gè)基因型的愈傷組織每次測定5 000個(gè)細(xì)胞,重復(fù)3次。

1)用鋒利的刀片對愈傷組織和葉片進(jìn)行機(jī)械破碎,破碎過程中加入700～800 mL的緩沖液A[15 mmol/L T ris-HCl(pH 7.5),80 mmol/L KCl,20 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA-Na2,15 mmol/L巰基乙醇,0.1%(V/V)T ritonX-100,0.5 mmol/L精氨四鹽酸(spermine·4HCl)],在緩沖液A中處理10 min。然后用300目(48 μ m)尼龍網(wǎng)過濾(濾液含1×105～2×105個(gè)細(xì)胞),將濾液離心(2 000 r/min,5 min)。離心后棄去上層清液,取沉淀物加緩沖液A(700～800 mL),打散后用300目尼龍網(wǎng)過濾。取濾液離心(2 000 r/min,5 min),離心后棄去上層清液,取沉淀物加 RNase A溶液(50 mg/L)1 mL,處理10 min,去除RNA,然后離心(2 000 r/min,5 min)。離心后棄去上層清液,取沉淀物加入1.6 mL HR-B DAPI染色液(partec high resolution staining kit)染色30～60 s,完成細(xì)胞核染色,細(xì)胞核懸浮液制備完成。

2)以已知的四倍體苜蓿葉片(2n=4x=32)為對照。調(diào)整分析儀的放大倍數(shù),使對照的DNA峰值處在200道附近。峰值處在100道的樣本為二倍體,而處在300和400道的分別為三倍體和八倍體,其余的為嵌合體。嵌合體又根據(jù)峰值位置確定其構(gòu)成細(xì)胞的倍性。

3)將1)所得細(xì)胞核懸浮液用調(diào)整好的流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,DNA含量的分布曲線圖由儀器自動(dòng)生成。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用DPAC(Data Pool Application of Cytometre)軟件分析DNA含量的分布曲線圖,得出S期細(xì)胞百分率和DNA含量整倍性變異與非整倍性變異細(xì)胞百分率,采用SPSS 10.0軟件分析愈傷組織繼代時(shí)間與DNA含量變異率之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖的分析

將苜蓿愈傷組織細(xì)胞核懸浮液和苜蓿葉片細(xì)胞核懸浮液放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量的測定,檢測完畢后流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成DNA含量分布曲線圖。

自選系大葉0510(2n=4x=32)葉片DNA含量分布曲線圖中出現(xiàn)1個(gè)G1/G0峰值,峰值在200道附近(圖1)。自選系大葉0510花藥愈傷組織繼代3周后的曲線圖,除1個(gè)主峰外還有1個(gè)峰,位置位于主峰DNA含量2倍的地方(圖2)。主峰峰值為107.23,第2個(gè)峰的峰值為194.16,它們的比值約等于2。由此可看出自選系大葉0510花藥愈傷組織的一部分細(xì)胞倍性發(fā)生了變異。

其余23個(gè)樣本的DNA含量分布曲線圖均表現(xiàn)出與此相似的分布曲線,即DNA含量分布曲線圖上均出現(xiàn)第2個(gè)峰,愈傷組織的一部分細(xì)胞倍性都發(fā)生了變異。另外,Sanditi的2個(gè)繼代周期的樣本、自選系大葉0510一個(gè)繼代周期的樣本DNA含量分布曲線圖上還出現(xiàn)了3個(gè)峰的現(xiàn)象。說明愈傷組織在培養(yǎng)過程中不僅出現(xiàn)了染色體加倍的現(xiàn)象,而且出現(xiàn)了多倍性變異和非整倍變異的現(xiàn)象。

2.2 苜?；ㄋ幱鷤M織S期細(xì)胞百分率及DNA含量變異率的分析

愈傷組織DNA含量出現(xiàn)加倍的現(xiàn)象,可能是愈傷組織出現(xiàn)了多倍性變異,也可能是愈傷組織細(xì)胞處于有絲分裂S期,DNA進(jìn)行復(fù)制導(dǎo)致DNA含量加倍。為了證實(shí)DNA含量加倍是多倍性變異引起的還是由于細(xì)胞處于S期而出現(xiàn)的,采用DPAC分析軟件對愈傷組織DNA含量分布曲線圖進(jìn)行分析,得到了自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi 8個(gè)繼代周期愈傷組織DNA含量變異細(xì)胞百分率和S期細(xì)胞百分率(表1)。

圖1 自選系大葉0510葉片DNA含量分布曲線圖(對照)Fig.1 DNA content distribution of M.sativa leave(as control)

圖2 自選系大葉0510花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖Fig.2 DNA content distribution of M.sativa callus

表1 3個(gè)基因型8個(gè)繼代周期的紫花苜蓿愈傷組織DNA含量變異百分率和S期細(xì)胞百分率Table 1 The percentage of DNA content variation cells and the percentage of S stage cells of M.sativa callus

自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的花藥愈傷組織的8個(gè)繼代培養(yǎng)周期的樣本都出現(xiàn)DNA含量變異現(xiàn)象(表1),且不同基因型、不同繼代時(shí)間DNA含量變異率都不相同。變異最大的是自選系大葉0510繼代15周時(shí)的樣本,DNA含量變異率達(dá)到19.45%。變異最小的是自選系多葉0501未經(jīng)過繼代培養(yǎng)的樣本,DNA含量變異率為2.05%。

在8個(gè)繼代培養(yǎng)周期中,自選系大葉0510的愈傷組織有5個(gè)階段S期細(xì)胞百分率為0,不處于S期(表1);自選系多葉0501有2個(gè)階段不處于S期;Sanditi有3個(gè)階段不處于S期,這10個(gè)樣本真正出現(xiàn)了多倍性變異。另外,自選系大葉0510愈傷組織繼代9周的樣本、自選系多葉0501愈傷組織繼代15周的樣本、Sanditi愈傷組織繼代15周的樣本,DNA含量變異細(xì)胞百分率都大于S期細(xì)胞百分率,說明這3個(gè)階段的愈傷組織也出現(xiàn)了多倍性變異。從以上得出24個(gè)樣本中有13個(gè)樣本出現(xiàn)了多倍性變異,這表明約65%的愈傷組織真正出現(xiàn)了多倍性變異。由此可知,在紫花苜蓿愈傷組織中倍性變異是普遍存在的。另外,自選系大葉0510有2個(gè)繼代培養(yǎng)階段,自選系多葉0501有5個(gè)階段,Sanditi有4個(gè)階段愈傷組織的S期細(xì)胞百分率大于DNA含量變異細(xì)胞百分率,其原因可能是細(xì)胞分裂的非同步性造成的。細(xì)胞分裂在S期內(nèi)不同的細(xì)胞所處狀態(tài)不同,就可能出現(xiàn)S期細(xì)胞百分率較大而DNA含量變異細(xì)胞百分率較小的現(xiàn)象。細(xì)胞處在分裂間期的S期時(shí),DNA進(jìn)行復(fù)制,含量也會(huì)加倍,這會(huì)引起DNA含量變異細(xì)胞百分率增高,S期及細(xì)胞分裂結(jié)束后DNA含量變異細(xì)胞百分率會(huì)略有下降。

S期細(xì)胞數(shù)占整個(gè)細(xì)胞群體數(shù)目的比率反映細(xì)胞分裂程度。自選系大葉0510的愈傷組織在繼代3周時(shí)細(xì)胞開始分裂,繼代9周時(shí)停止分裂(表1)。自選系多葉0501未經(jīng)繼代的樣本細(xì)胞已經(jīng)開始分裂,繼代15周時(shí)細(xì)胞停止分裂。Sanditi愈傷組織繼代培養(yǎng)3周時(shí)細(xì)胞開始分裂,繼代培養(yǎng)15周時(shí)停止分裂。說明紫花苜蓿愈傷組織品種間的細(xì)胞周期長短存在差異,自選系多葉0501愈傷組織生長周期最長,其次為Sanditi,而自選系大葉0510愈傷組織生長周期最短。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間與DNA含量變異率之間的相關(guān)分析

通過DPAC軟件對苜蓿花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖的分析表明,3個(gè)基因型花藥愈傷組織繼代時(shí)間不同,DNA含量變異細(xì)胞百分率也不同。

自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的花藥愈傷組織繼代時(shí)間與DNA含量變異率之間的相關(guān)系數(shù)分別是r2=0.792(P<0.05)、r2=0.826(P<0.05)、r2=0.843(P<0.05)(圖3～5),這說明二者具有相關(guān)性。自選系大葉0510的花藥愈傷組織DNA含量變異細(xì)胞百分率在一定時(shí)間內(nèi),隨著繼代時(shí)間的增長,呈增加趨勢。DNA含量變異細(xì)胞百分率在繼代0～12周時(shí)迅速增加,為集中變異期。之后,隨著繼代次數(shù)的增加,逐漸趨于穩(wěn)定。自選系多葉0501、Sanditi花藥愈傷組織8個(gè)繼代培養(yǎng)時(shí)間段中,DNA含量變異細(xì)胞百分率的時(shí)相分布呈相同的趨勢。

圖3 自選系大葉0510花藥愈傷組織在8個(gè)時(shí)間段中DNA含量變異細(xì)胞百分率時(shí)相分布Fig.3 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods

圖4 自選系多葉0501花藥愈傷組織在8個(gè)時(shí)間段中DNA含量變異細(xì)胞的百分率時(shí)相分布Fig.4 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods callus

3 討論

圖5 Sanditi花藥愈傷組織在8個(gè)時(shí)間段中DNA含量變異細(xì)胞的百分率時(shí)相分布圖Fig.5 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods

本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對3個(gè)基因型8個(gè)繼代周期的苜蓿愈傷組織DNA含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明,在紫花苜蓿愈傷組織中倍性變異普遍存在。這與在玉米[5]、小麥(Triticum aestivum)[9,10]中的研究結(jié)果相同。絕大多數(shù)愈傷組織的第2個(gè)峰值是第1個(gè)峰值的2倍。這是因?yàn)?正在進(jìn)行分化的細(xì)胞中,DNA不斷地周期性復(fù)制,而不進(jìn)入有絲分裂,結(jié)果產(chǎn)生多倍體細(xì)胞,這些細(xì)胞在正常條件下不再分裂,在離體條件下能誘導(dǎo)這些細(xì)胞分裂,則導(dǎo)致愈傷組織細(xì)胞倍性變異[15,16],愈傷組織的誘導(dǎo)階段是體細(xì)胞變異的關(guān)鍵階段,細(xì)胞的啟動(dòng)分裂也可能導(dǎo)致倍性變異[2]。苜蓿愈傷組織在培養(yǎng)過程中不僅出現(xiàn)了染色體加倍的現(xiàn)象,而且出現(xiàn)了多倍性變異和非整倍性變異。細(xì)胞倍性的變化表現(xiàn)出遺傳的不穩(wěn)定性,整倍體、非整倍體、混合體在許多植物的組培過程中都會(huì)出現(xiàn)[11,12]。這是由于在愈傷組織細(xì)胞中進(jìn)行較多的無絲分裂,難以保證子細(xì)胞中染色體的穩(wěn)定性,從而產(chǎn)生各種染色體數(shù)目變異,有絲分裂異常也可能導(dǎo)致子細(xì)胞中染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異[13,14]。但是,在愈傷組織中有DNA含量加倍的現(xiàn)象是否就一定是染色體數(shù)目發(fā)生變化,不能僅僅通過DNA含量分布來下結(jié)論,還需對其進(jìn)行細(xì)胞周期分析。因?yàn)榧?xì)胞處在分裂間期的S期時(shí),DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)DNA含量也會(huì)出現(xiàn)加倍的現(xiàn)象。

愈傷組織在繼代過程中會(huì)發(fā)生大量的變異,長期繼代的愈傷組織不僅分化能力下降,而且繼代時(shí)間越長,變異越復(fù)雜,變異率越高[17,18]。本試驗(yàn)通過分析不同繼代周期愈傷組織DNA變異細(xì)胞的百分率,發(fā)現(xiàn)隨著繼代時(shí)間的增長,染色體變異有增加的趨勢。但是,這種趨勢并不是隨著時(shí)間的增長,無限增加的。繼代0～12周是愈傷組織變異的高發(fā)期,以后隨著繼代次數(shù)的增加,變異趨向于穩(wěn)定。這個(gè)結(jié)果可能是由于多倍體變異細(xì)胞在不斷產(chǎn)生的同時(shí)也通過細(xì)胞程序性死亡途徑不斷被淘汰[19～21]形成的,所以DNA含量變化的細(xì)胞比例總在一定的范圍之內(nèi)。其他作物上也出現(xiàn)了相同的情況,如水稻愈傷組織在試管中繼代時(shí)間越長,發(fā)生變異率越高[3]。繼代20周的水稻花藥再生植株發(fā)生性狀改變的比例高達(dá)88%,而繼代4～6周的再生植株發(fā)生性狀改變的比例為63%;從染色體水平來看,愈傷組織繼代時(shí)間不同,再生植株內(nèi)染色體組的倍性變化也不同,不進(jìn)行繼代培養(yǎng)而分化成苗所形成的再生植株中單倍體、二倍體和多倍體的比例分別為57%,43%和0;但如果愈傷繼代4～6周,再生植株中3種倍性植株的比例為20%,84%和3%;繼代20周的愈傷再生植株中,這3種倍性植株的比例為7%,85%和11%[3]。Muller等[4]利用RFLP分子標(biāo)記來研究不同繼代時(shí)間對無性系變異的影響發(fā)現(xiàn)繼代9周的愈傷再生植株RFLP多態(tài)性為23%,而繼代4周的RFLP多態(tài)性為6.3%,說明長時(shí)間繼代培養(yǎng)可增加體細(xì)胞無性系DNA的多態(tài)性。這意味著在植物組織培養(yǎng)過程中,減少繼代次數(shù)或避開變異高發(fā)期可減少愈傷組織階段的變異,進(jìn)而獲得遺傳穩(wěn)定性高的再生植株。通過分析不同繼代次數(shù)愈傷組織的變異,可以更好的利用和避免紫花苜蓿組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)體細(xì)胞變異。

[1］楊磊,王彥榮,余進(jìn)德.干旱荒漠區(qū)土壤種子庫研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(2):227-234.

[2］Larkin P J,Scowcroft W P.Somalia variation a novel source of variability from cell-cultures for plant improvement[J].Theoretical and Applied Genetics,1981,60:197-214.

[3］Yoshida S Y,Kazuhiko W,M orihiro F J.Non-random game to clone variation in rice regenerate from callus subcultures for a prolonged period under high somatic stress[J].Euphytica,1998,104:87-94.

[4］Muller E,Brown P T,Harked S,et al.DNA variation in tissue-culture-derived rice plants[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,80:673-679.

[5］谷明光.玉米花粉單倍體植株染色體上異染色質(zhì)的變異[J].遺傳學(xué)報(bào),1991,18(3):235-238.

[6］崔廣榮,張子學(xué),張從宇.文心蘭多倍體誘導(dǎo)及其鑒定[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(1):184-190.

[7］云嵐,云錦鳳,李俊琴.新麥草愈傷組織多倍體誘導(dǎo)與倍性鑒定[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(6):126-131.

[8］陳智勇,胡忠紅,蔣建雄.早熟禾族3種基因型草坪草的染色體核型分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(6):281-285.

[9］李士生.小麥愈傷組織及再生植株的染色體變異[J].遺傳學(xué)報(bào),1991,18(4):332-338.

[10］梁虹,陳耀鋒,王睿輝,等.小麥幼胚體細(xì)胞無性系及其繼代過程的微觀結(jié)構(gòu)觀察[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,6(9):62-67.

[11］Phillips R L,Kaepler S M,OLhoft P.Genetic Instability of Plant Tissue Culture:Breakdown if Normal Controls[M].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1998,91:5222-5226.

[12］Barcaccia G,Rosellini D,Falcinelli M,etal.Reproductive behaviour of tetraploid alfalfa plants obtained by unilateral and bilateral sexual polyploidization[J].Euphyatica,2002,99(3):18-24.

[13］胡鈉梅,韓素英,梁國魯.中間錦雞兒染色體變異研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,10:75-79.

[14］張玉靜.分子遺傳學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:27.

[15］商效民.植物離體培養(yǎng)中染色體的變異[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,1984,(1):5-12.

[16］黃曉梅,李桂英,梁艷,等.組織培養(yǎng)中大蔥染色體倍性變異的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(1):50-56.

[17］M yers J M,Simon P W.Regeneration of garlic callus as affected by colonel variation,plant growth regulators and culture conditions over time[J].Plant Cell Report,1999,19(1):32-36.

[18］Bouman H G,De Klert J.Measurement of the extent of soma clone variation in begonia plants regenerated under various conditions,comparison of three assays[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,12(1):111-117.

[19］Hao Y J,You C X,Deng X X.Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methyl nation sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cypresses ration[J].Cryoletters,2006,21:37-46.

[20］Hao Y J,You C X,Deng X X.Effects of cryopreservation on developmental competence,cytological and molecular stability of citrus callus[J].Cryoletters,2006,23(1):27-35.

[21］Hao Y J,Deng X X.Occurrence of chromosomal variations and plant regeneration from long-term cultured citrus callus[J].Biologia Plantarum,2002,38(5):32-38.