0～56日齡舍飼肉用羔羊前胃功能發(fā)育研究

郭江鵬,潘建忠,李發(fā)弟,2＊ ,郝正里,馬友記,張?jiān)d,李海靜,馬騰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州730070;2.甘肅省飼料工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州730070)

瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃構(gòu)成的前胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官,是其進(jìn)行微生物消化和物理消化的主要場所[1]。反芻動(dòng)物前胃的正常發(fā)育,除受種別、年齡和體重影響外,還有若干因子影響其功能發(fā)育,而飼糧組成及形態(tài)、飼養(yǎng)管理模式等因素最為重要[2]。研究表明,犢牛前胃結(jié)構(gòu)和生理功能的發(fā)育在很大程度上是采食飼料及其代謝產(chǎn)物影響的結(jié)果[3,4];犢牛采食飼料可促進(jìn)胃部肌肉組織發(fā)育,提高瘤胃的蠕動(dòng)水平及揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)的產(chǎn)生和吸收水平[5];碳水化合物可在瘤胃微生物及其分泌的復(fù)合酶和代謝產(chǎn)物的作用下逐步降解成單糖被瘤胃微生物利用,并轉(zhuǎn)化為VFAs(特指各種揮發(fā)性脂肪酸,而VFA一般是對(duì)揮發(fā)性脂肪酸的統(tǒng)稱)等物質(zhì),為反芻動(dòng)物新陳代謝過程提供能源[6]。以瘤胃內(nèi)容物的pH值、VFAs的摩爾組成比例作為研究瘤胃發(fā)酵的主要內(nèi)環(huán)境指標(biāo),基本上可以反映瘤胃的內(nèi)部環(huán)境狀況及飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式[7,8]。反芻動(dòng)物瘤胃黏膜不分泌任何酶,其中的酶由微生物分泌,酶的活性、種類與微生物的數(shù)量、種類有關(guān)[9];瘤胃內(nèi)容物中微生物酶的活性在一定程度上可以反應(yīng)微生物的定植與完善程度。因此,以前胃內(nèi)容物相對(duì)重量、內(nèi)容物pH值及瘤胃VFAs的濃度、摩爾比和微生物蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性等作為指標(biāo),可較為全面地反映幼年反芻動(dòng)物過渡為功能性反芻動(dòng)物的前胃發(fā)育過程。

Wardrop和Coombe[10]曾假設(shè)認(rèn)為,放牧羔羊瘤胃生理和功能發(fā)育可分為3個(gè)階段:即0～3周齡的非反芻階段,3～8周齡的過渡階段和8周齡以上的成年反芻階段;Poe等[11]證實(shí)這一階段劃分同樣適合于補(bǔ)飼的舍飼羔羊。但近年來,隨著品種改良、飼料生產(chǎn)技術(shù)改進(jìn)和飼養(yǎng)管理模式改善,肉羊生產(chǎn)現(xiàn)狀在品種、飼草料及飼養(yǎng)管理等方面都發(fā)生了很大變化,國內(nèi)外近年來雖對(duì)綿羊羔羊前胃(尤其是瘤胃)功能的發(fā)育有較多研究[12-25],但有關(guān)舍飼條件下肉用羔羊前胃功能發(fā)育變化的研究尚未見報(bào)道,Wardrop和Coombe[10]的假設(shè)是否仍適用于目前我國舍飼并早期補(bǔ)飼條件下肉用羔羊的瘤胃生理和功能發(fā)育過程,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究選用舍飼甘肅肉用綿羊新品種選育群公羔,研究了0～56日齡羔羊前胃各室內(nèi)容物相對(duì)重量、pH值、瘤胃內(nèi)容物VFA及主要微生物消化酶等指標(biāo)的發(fā)育變化特點(diǎn),為較全面了解舍飼條件下肉用羔羊前胃功能的發(fā)育變化,進(jìn)而制定舍飼哺乳肉用羔羊早期飼養(yǎng)管理策略,開發(fā)相應(yīng)補(bǔ)飼技術(shù)和產(chǎn)品,實(shí)現(xiàn)羔羊早期培育和早期斷奶等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2009年2-5月進(jìn)行。從甘肅省永昌肉用種羊場選擇健康、生長發(fā)育正常的群飼甘肅肉用綿羊新品種選育群公羔(單羔)45只(平均初生重及宰前活重見表1),按組間出生體重相近的原則分為9組。以日齡為單因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),分9個(gè)處理,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只羊;分別于產(chǎn)后0,7,14,21,28,35,42,49,56 d不禁食狀態(tài)下稱活重,而后屠宰、取樣,測定瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃的相關(guān)指標(biāo)。

表1 羔羊初生重和宰前活重Table 1 Birthweight and live weight in lambs kg

1.2 羔羊屠宰前的飼養(yǎng)管理

羔羊隨同母羊接受全舍飼飼養(yǎng)。出生后0.5～1.0 h內(nèi)吸吮初乳,之后置羔羊欄中,每日11:30-13:30,16:30-18:30,21:30-次晨8:30放入母羊欄吮吸母乳。于產(chǎn)后7 d開始,投放誘食精料補(bǔ)充料(配方及營養(yǎng)成分見表2)及優(yōu)質(zhì)苜蓿干草(鍘短至3cm左右,營養(yǎng)成分:干物質(zhì) 92.50%,粗蛋白質(zhì) 16.72%,粗脂肪2.16%,粗纖維17.44%,粗灰分10.69%,鈣15.57 g/kg DM,磷9.84 g/kg DM),令羔羊自由采食,并供應(yīng)充足的清潔飲水。

表2 精料補(bǔ)充料組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrition level of concentrate supplement(air-dry basis)

1.3 屠宰、樣品采集與重量、pH 值測定

稱羔羊宰前活體重后,頸靜脈放血致死。立即打開腹腔,按照《家畜解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)》[27]所述,將胃分為瘤網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃,結(jié)扎各部位連接處。稱取傾出內(nèi)容物前、后的各胃室重量后,立即測定內(nèi)容物pH值;而后混勻各胃室內(nèi)容物、采樣;將樣品傾入10 mL離心管置液氮中速凍后,轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱中保存,以待測定VFAs和瘤胃主要微生物酶。

羔羊初生重、宰前活重、各胃室內(nèi)容物重量:用電子秤(載量30 kg,感量為0.1 g)稱取。全胃內(nèi)容物重量為瘤網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃3部分內(nèi)容物重量之和。

內(nèi)容物pH值:用賽多利斯產(chǎn)PB-10型pH計(jì)現(xiàn)場測定[28]。

1.4 樣品預(yù)處理與測定

樣品預(yù)處理采用楊子江等[28]的方法。測定前低溫(4～10℃)解凍樣品,在未完全解凍前用分析天平(載量200 g,感量為0.000 1 g)稱重,按1∶5(W/V)加入4℃的0.4 mol/L氯化鉀溶液冰浴勻漿45 s,4℃、12 000 r/min離心10 min,將上清液分裝至5 mL冷凍管中置于-70℃保存?zhèn)錅y。

瘤胃內(nèi)容物VFAs測定采用楊子江等[28]的方法。用安捷倫(Aglient)6890N氣相色譜儀測定。色譜柱為19091 N-213。測定條件為:進(jìn)樣口溫度220℃,載氣(N2)流量 2.0 mL/min,分流比40∶1,進(jìn)樣量0.6 μ L;程序升溫:120℃保持3 min,而后升高 10℃/min,180℃保持1 min;FID溫度為250℃;氫氣 40 mL/min,空氣 450 mL/min,尾吹氣45 mL/min。

瘤胃內(nèi)容物蛋白質(zhì)含量按楊子江[29]對(duì)Folin-酚法[30]改進(jìn)后的方法測定。

瘤胃內(nèi)容物主要微生物酶活性:蛋白酶活性用李啟鵬[19]改進(jìn)的萃取化學(xué)公司法[31]測定,淀粉酶活性用Bernfeld法[31]測定,纖維素酶活性用萃取化學(xué)公司法[31]測定。規(guī)定在38℃、pH 6.9的條件下,水解酪蛋白每min產(chǎn)生酪氨酸1 μ g為1個(gè)蛋白酶活性單位[31]。1個(gè)α-淀粉酶單位相當(dāng)于在38℃和pH 6.9條件下,從可溶性淀粉中釋放1 μ mol麥芽糖所需的酶量[31]。1個(gè)纖維素酶單位相當(dāng)于每min釋放出0.1 μ mol葡萄糖的還原糖時(shí)所需的酶量[31]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著時(shí)用 Tukey(同質(zhì)數(shù)據(jù))或 Tamhane'2法(不同質(zhì)數(shù)據(jù))作多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“Mean±SD”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊前胃各室內(nèi)容物相對(duì)重量的日齡變化

羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%活體重量)在0～42 d呈增高趨勢,42～49 d顯著增加(P<0.05),28和35 d分別為0 d的24.95和36.55倍;49 d時(shí)達(dá)到最高,為0 d值的68.89倍(表3)。瓣胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%活體重量)為0.02%～0.12%,變化幅度明顯較小。羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%全胃內(nèi)容物重量)在0～35 d呈線性增加(R2=0.93,P=0.00),其中7～14,21～28,28～35 d顯著增加(P<0.05),之后在74.44%～80.73%波動(dòng);49 d時(shí)達(dá)到最高(80.73%),是0 d的15.18倍。瓣胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%全胃內(nèi)容物重量)為0.31%～1.34%,總體隨日齡呈下降趨勢。

2.2 羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值的日齡變化

0與7 d前胃各室內(nèi)容物pH值較低,以后隨日齡增長稍有升高且較穩(wěn)定,各日齡間差異均不顯著(P>0.05)(表4);其中瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃內(nèi)容物 pH 值分別為5.30～6.03,5.37～6.42和5.39～6.15。

2.3 羔羊瘤胃內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸含量的日齡變化

在0 d時(shí)全部參試羔羊均未被檢出VFAs,7 d時(shí)有個(gè)別羔羊樣被檢出;21 d之前,所有羔羊均未被檢出異丁酸、異戊酸。隨日齡增長,各種VFA濃度均呈上升趨勢,其中TVFA(total volatile fatty acids,TVFA)、乙酸、丁酸和戊酸在21～28 d顯著(P<0.05)增高或呈增高(P>0.05)的趨勢,TVFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度在28 d分別為其首次檢出日齡(14或21 d)的11.90,8.26,18.31,38.21和5.90倍;之后戊酸濃度相對(duì)穩(wěn)定,TVFA、乙酸、丙酸穩(wěn)步增高(49 d值除外),丁酸濃度的變化不甚規(guī)律(表5)。與42 d相比,49 d的 TVFA、乙酸和丙酸均顯著增高,可能突顯了該時(shí)段受試羔羊的個(gè)體特點(diǎn)。

表3 羔羊前胃各室內(nèi)容物相對(duì)重量的日齡變化Table 3 Relative weight of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days %

14 d時(shí)乙酸摩爾比和乙酸/丙酸(acetic/propionic,A/P)顯著高于其他日齡階段(P<0.05),而丙酸和丁酸摩爾比顯著低于其他日齡階段(P<0.05)(表6)。在其他日齡階段,僅28 d丁酸摩爾比顯著高于35,42和56 d(P<0.05);各日齡階段乙酸、丙酸、丁酸和戊酸摩爾比及A/P分別為 0.565～0.676,0.181～0.259,0.115～0.194,0.017～0.028和2.175～3.822。

表4 羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值的日齡變化Table 4 pH value of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days

2.4 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物酶比活性的日齡變化

0 d時(shí)即從2只羔羊瘤胃內(nèi)容物檢出了纖維素酶比活性,自7 d開始所有參試羔羊均被檢出纖維素酶比活性;其他2種微生物酶在各日齡階段參試羔羊中均被檢出。瘤胃內(nèi)容物微生物酶(蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶)比活性存在較大的個(gè)體差異,隨著日齡的增長,3種微生物酶的比活性均呈增高趨勢(表7)。21 d以后的蛋白酶比活性均為7 d的1.5倍以上,以56 d最高(2.66倍);7 d始的各日齡段,α-淀粉酶比活性均為0 d值的3倍以上,49 d為其6.06倍;纖維素酶比活性在14 d有較大的上升,為7 d值的2.81倍,以后日齡增幅放緩,56 d達(dá)到7 d的4.00倍。

3 討論

3.1 日齡對(duì)羔羊前胃各室內(nèi)容物相對(duì)重量變化的影響

前人研究表明,當(dāng)反芻動(dòng)物采食飼料后,網(wǎng)胃和瘤胃開始迅速增大,羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物占活重的百分率隨年齡增長而遞增[2]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相符,羔羊0 d時(shí)瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物僅為活體重量的0.15%,而28,35和42 d分別為3.79%,5.56%和7.05%,與韓正康和陳杰[2]的3.9%,4.6%和8.6%甚為相近。所測瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%全胃內(nèi)容物重量)在7,14,21,28,42和56 d分別為11.09%,25.63%,37.26%,61.54,77.37%和74.44%,與王彩蓮等[13]完全放牧不補(bǔ)飼條件下相應(yīng)日齡的13.77%,24.60%,64.25%,64.26%,69.21%和78.15%相比,僅21 d值明顯偏低。舍飼且早期充分補(bǔ)飼精補(bǔ)料與苜蓿干草條件下羔羊能按需要采食,瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物重量能有規(guī)律地增長;而全放牧條件下羔羊各時(shí)段的牧草覓食量受放牧地可食牧草產(chǎn)量與質(zhì)量制約,故其瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物重量的增長不甚規(guī)律。本試驗(yàn)羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物在7～14 d顯著增長,說明7 d開始補(bǔ)飼的辦法對(duì)羔羊前胃內(nèi)容物重量的增加具有明顯的促進(jìn)作用。在28 d時(shí)羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%全胃內(nèi)容物重量)為 61.54%,35 d時(shí)為76.87%,表明在本試驗(yàn)條件下,羔羊在28 d時(shí)已具備了實(shí)施早期斷奶的前胃功能基礎(chǔ),與郭江鵬等[32]通過分析羔羊各胃室重量和容積發(fā)育等指標(biāo)得出的結(jié)論

——“在舍飼并早期補(bǔ)飼條件下35 d或提早到28 d進(jìn)行羔羊早期斷奶是可行的”一致。

表5 羔羊瘤胃內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸濃度的日齡變化Table 5 VFA concentration of rumen contents in lambs at different age in days mmol/L

表7 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物酶比活性的日齡變化Table 7 Activity of microbic enzymes of rumen contents in lambs at different age in days U/mg蛋白質(zhì)Protein

本試驗(yàn)中羔羊瓣胃內(nèi)容物相對(duì)重量(%活體重量,%全胃內(nèi)容物重量)存在波動(dòng),沒有明顯的規(guī)律,與王彩蓮等[13]的結(jié)果相似,可能與瓣胃承擔(dān)的生理功能及其內(nèi)容物存量較少有關(guān),個(gè)體間差異較大亦是影響因素。

3.2 日齡對(duì)羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值及VFA含量變化的影響

瘤胃內(nèi)容物pH值是反映瘤胃發(fā)酵狀況的綜合指標(biāo),受飼糧性質(zhì)(飼糧結(jié)構(gòu)、物理形式、原料種類及其加工形式)、唾液分泌、瘤胃內(nèi)VFA及其他有機(jī)酸的生成、吸收和排出、飼喂模式等因素的綜合影響[33]。本研究前胃各胃室內(nèi)容物pH值均隨日齡增長而稍有上升,是羔羊飼草料采食量逐漸增加、反芻行為逐步出現(xiàn)、唾液分泌量增加及其中和作用增強(qiáng)等因素綜合作用的結(jié)果。本試驗(yàn)所測前胃各室pH值較王彩蓮等[13]所報(bào)道(6.03～6.67,6.19～6.83和4.95～6.71)和成年反芻動(dòng)物均低,是由本試驗(yàn)條件所致;補(bǔ)飼可為羔羊瘤胃發(fā)酵提供更多的易發(fā)酵碳水化合物,進(jìn)而導(dǎo)致各胃室pH的降低;較小年齡羔羊(0～56 d)尚不具備成年反芻動(dòng)物完善的反芻功能,使唾液對(duì)胃酸的中和能力降低。按Wardrop和Coombe[10]的假設(shè),放牧羔羊瘤胃生理和功能發(fā)育,0～3周齡的非反芻階段,3～8周齡為過渡階段,8周齡以上為成年反芻階段。可看出,這一假設(shè)同樣也適合于舍飼且進(jìn)行早期補(bǔ)飼的羔羊。

瘤胃內(nèi)容物的pH值并不直接影響瘤胃的發(fā)育,但它的變化可反映瘤胃VFAs比例的變化,而且直接影響到瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)VFA的吸收和代謝,從而間接影響瘤胃發(fā)育[34]。VFA是瘤胃發(fā)酵的主要終產(chǎn)物,反映了微生物活性和瘤胃內(nèi)VFAs的吸收、排出或被中和的狀況;飼料類型可顯著影響VFA的總量和各種酸的比例,采食精料型飼糧和顆粒飼料,可使VFA水平升高,并提高丙酸的摩爾比[2]。本試驗(yàn)結(jié)果與王彩蓮等[13]完全放牧不補(bǔ)飼條件下相應(yīng)日齡羔羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量、A/P存在較大的差別,和朱文濤等[12]4種飼糧條件下(飼糧1:11.91 MJ/kg消化能,20.11%粗蛋白質(zhì);飼糧2:11.91 MJ/kg消化能,14.02%粗蛋白質(zhì);飼糧3:8.15 MJ/kg消化能,20.09%粗蛋白質(zhì);飼糧4:8.15 MJ/kg消化能,14.26%粗蛋白質(zhì))相近日齡羔羊上述指標(biāo)的差異也明顯。本試驗(yàn)乙酸和丁酸含量明顯高于上述報(bào)道,但丙酸含量高于王彩蓮等[13](3.559～14.936 mmol/L)而低于朱文濤等[12]的結(jié)果(34.3～42.6 mmol/L),進(jìn)一步證實(shí)了飼料類型可顯著影響VFA的總量和各種揮發(fā)酸比例的結(jié)論。此外,本試驗(yàn)測出瘤胃內(nèi)容物中含有較高的丙酸、丁酸濃度,及郭江鵬等[32]舍飼條件下7 d開始的充足補(bǔ)飼能促使各胃室重量和容積的發(fā)育提前7～14 d的結(jié)論,均與前人在正常生理范圍內(nèi),較低的瘤胃pH值不但會(huì)引起丙酸、丁酸產(chǎn)量提高,而且能夠加強(qiáng)瘤胃上皮對(duì)它們的吸收,從而有利于幼齡反芻動(dòng)物前胃的迅速發(fā)育的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)A/P在2.18～3.82內(nèi),表明羔羊瘤胃仍以乙酸發(fā)酵類型為主導(dǎo)。研究表明,在足夠的還原型輔酶II(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,nicotinamide adeninedinucleotide phosphate-reduced,NADpH)存在的條件下,乙酸和丁酸用于合成脂肪時(shí)的理論量熱效率較高[2],而丙酸的葡萄糖異生途徑是反芻動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生NAD-pH的重要途徑。本試驗(yàn)較高的丙酸含量保證了羔羊體內(nèi)葡萄糖異生前體的較充足供給,為乙酸、丁酸的高效供能提供了足夠的NADpH,從而保證了本試驗(yàn)采用的飼養(yǎng)模式有較好的飼養(yǎng)效果。

3.3 日齡對(duì)羔羊瘤胃主要微生物酶比活性變化的影響

反芻動(dòng)物的年齡、飼糧類型及飼養(yǎng)管理模式對(duì)瘤胃中各種微生物酶的種類和數(shù)量有顯著的影響[35,36]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,纖維素酶比活性的出現(xiàn)存在時(shí)間差異,證實(shí)了王彩蓮等[13]有關(guān)研究的報(bào)道。本試驗(yàn)中,瘤胃內(nèi)容物中微生物蛋白酶、α-淀粉酶和纖維素酶比活性的較高活性日齡分別出現(xiàn)在21,7和14 d,與他人研究存在差異。王彩蓮等[13]分別出現(xiàn)在14,42和28 d;趙恒波等[15]結(jié)果為60 d時(shí)3種酶活性較高;kmet等[36]試驗(yàn)表明,羔羊瘤胃內(nèi)容物蛋白酶和α-淀粉酶活性在20 d時(shí)達(dá)到最高峰,纖維素酶在30 d時(shí)呈峰值;Bomba等[37]研究表明,在常規(guī)飼喂方式下,羔羊瘤胃液淀粉酶活性在2～6周明顯升高,纖維素酶活性在4周齡明顯升高。與前人報(bào)道存在差異可能緣于本試驗(yàn)采用的7日齡開始的補(bǔ)飼策略,羔羊在較早的日齡采食到高營養(yǎng)濃度的顆粒型精補(bǔ)料及優(yōu)質(zhì)飼草,促進(jìn)了分泌蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的相關(guān)微生物區(qū)系的定植和完善,進(jìn)而提早了淀粉酶和纖維素酶比活性的增高與穩(wěn)定。

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