解郁舒心片中黃酮類化合物的HPLC和UV法測定

宋 英 宋 崎 周小初 王建新

（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；2.上海開拓者醫(yī)藥發(fā)展有限公司，上海 201203；3.上海市中藥研究所，上海201240）

貫葉金絲桃（Hypericum perforatum L.）是藤黃科金絲桃屬植物，在歐洲具有悠久的抗抑郁臨床應(yīng)用歷史。近年來對貫葉金絲桃的藥理研究發(fā)現(xiàn)，它還具有抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病毒、抗乙肝病毒等多方面的藥理活性[1]。貫葉金絲桃及其提取物是近年來歐美最暢銷的植物藥之一。研究表明，貫葉金絲桃的主要化學(xué)成分包括（1）苯并二蒽酮類，如金絲桃素、偽金絲桃素等；（2） 黃酮類化合物，包括槲皮素、金絲桃甙、蘆丁、阿曼托黃素等；（3）間苯三酚類，如貫葉金絲桃素、加貫葉金絲桃素等；（4） 其他成分，包括揮發(fā)油類、香豆素類、原花青素等[2]。

國內(nèi)具有豐富的貫葉金絲桃資源，但目前基本上是經(jīng)過粗加工制成提取物后出口，尚未有貫葉金絲桃的藥物制劑被批準(zhǔn)上市。因此，筆者將貫葉金絲桃提取純化后，開發(fā)有效部位制劑解郁舒心片，并對制劑中金絲桃素類化合物、黃酮類化合物和貫葉金絲桃素的含量進(jìn)行了控制。其中，黃酮類化合物最高，而且具有一定的抗抑郁活性[3]，本研究對其測定方法HPLC和UV法進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

Agilent HP1100高效液相色譜儀，Agilent 110MWD檢測器；日本島津UV-2401pc紫外可見分光光度計(jì)。

金絲桃苷對照品、蘆丁對照品均由國家藥品生物制品檢定所提供；解郁舒心片（自制，批號：20090213、20090215、20090220）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的UV法測定

2.1.1 測定波長的選擇 樣品溶液經(jīng)波長掃描，最大吸收波長在（420±2）nm處，與蘆丁對照品一致?？瞻自噭┙?jīng)掃描在(420±2）nm處無吸收，因此選擇420nm為總黃酮測定波長。

2.1.2 樣品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，除去包衣，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置50mL量瓶中，加70%乙醇40mL超聲處理（功率350W，頻率35kHz）15min，放冷，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液5mL，置25mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取五氧化二磷減壓干燥24h的蘆丁對照品，用70%乙醇配制成1mL含蘆丁0.5mg的溶液，分別精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL的量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，分別精密量取各不同濃度對照品溶液5mL，加0.1mol/L三氯化鋁溶液3mL和1mol/L醋酸鉀溶液5mL，使混勻，放置40min，以試劑為空白，在420nm波長處測定吸收度（A），以濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：C=40.1644 A+0.0370，r=0.9999，表明在7.5～45.3μg/mL范圍內(nèi)總黃酮濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液（93.56μg/mL），連續(xù)測試5次，總黃酮含量的RSD為0.103%，表明本方法精密度良好。

2.1.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別取同一批樣品五份，按2.1.2 測定，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好，總黃酮平均含量為32.22%，RSD 1.79%。

2.1.6 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.1.2制備樣品溶液，放置0、1、2、4、6、8、12、24h各測1次，RSD 0.7%，表明樣品溶液中黃酮含量在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，在已知含量樣品中加入定量蘆丁對照品，按2.1.2 制備樣品溶液，240nm處測定吸收度，計(jì)算回收率，平均回收率為100.36%，RSD為2.58%。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.8 樣品測定 按2.1.2項(xiàng)對3批樣品進(jìn)行測定。見表2。

表2 3批樣品總黃酮含量測定結(jié)果

2.2 金絲桃苷和蘆丁的HPLC法測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱 shim-pack CLC-ODS（6.0mm ID×15cm）；水-乙腈-磷酸（825︰175︰1）為流動相；檢測波長為368nm;流速：1m L/m in。理論板數(shù)按金絲桃苷和蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。在此條件下，金絲桃苷和蘆丁均可以與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 樣品溶液的色譜圖

2.2.2 樣品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，除去包衣，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置50mL量瓶中，加70%乙醇40mL超聲處理（功率350W，頻率35kHz）15min，放冷，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣測定。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密稱取五氧化二磷減壓干燥24h的蘆丁、金絲桃苷對照品用70%乙醇分別配制成每1mL含蘆丁0.5mg、每1m L含金絲桃苷 0.06mg的溶液，各精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于10m L量瓶中，分別用70%乙醇定容至刻度，搖勻，各進(jìn)樣10μL，測定蘆丁、金絲桃苷峰面積。以進(jìn)樣量C對峰面積A進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：蘆丁C=0.02635+7.155×10-7A，r=0.9998，表明在0.45～4.50μg范圍內(nèi)蘆丁的進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。金絲桃苷C=8.218×10-3+4.783×10-7A，r=0.9999，表明在0.06～0.60μg范圍內(nèi)金絲桃苷的進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取含蘆丁和金絲桃苷的對照品溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果蘆丁和金絲桃苷含量的RSD分別為0.36%與0.29%，表明本方法精密度良好。

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別精密稱取同批樣品5份，按2.2.2測定，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好，蘆丁平均含量為5.67%，RSD 0.63%；金絲桃苷平均含量為3.07%，RSD 0.84%。

2.2.6 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2制備樣品溶液，放置0、1、2、4、6、8、12、24h各測1次，峰面積穩(wěn)定，RSD 為0.61%，0.50%，表明24h內(nèi)樣品溶液中蘆丁和金絲桃苷的含量穩(wěn)定。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，在已知含量樣品中加入定量對照品，進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

2.2.8 樣品測定 按2.2.2對3批樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 3批樣品中蘆丁和金絲桃苷的含量測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 顯色方法的選擇

在進(jìn)行UV法測定總黃酮的測試方法研究中，曾采用亞硝酸鈉與硝酸鋁溶液顯色法[4]，樣品溶液測試結(jié)果極不穩(wěn)定，30m in吸收度下降30%，故未采用。本測定條件主要參考資料[5]，采用三氯化鋁與醋酸鉀溶液顯色40m in，結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 提取分離條件的確定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，蘆丁、金絲桃苷均易溶于甲醇或乙醇，將樣品分別加甲醇或70%乙醇超聲30min，均全部溶解，分別測定含量，再將樣品加70%乙醇分別用不同超聲時間處理。由試驗(yàn)結(jié)果可知，以甲醇或70%乙醇為溶劑，提取結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮到甲醇毒性較大，故采用70%乙醇提取。不同超聲時間比較結(jié)果表明，超聲15min與超聲30、45、60min差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故確定以70%乙醇超聲處理15min為最佳提取條件。

3.3 UV法和HPLC法結(jié)合應(yīng)用控制含量

本研究中UV法測定的是總黃酮的含量，主要包括金絲桃甙、蘆丁、槲皮素、阿曼托黃素等，其含量以蘆丁計(jì)算。通過UV法和HPLC法的結(jié)合應(yīng)用，可以對解郁舒心片中總黃酮和主要的黃酮類成分金絲桃甙與蘆丁的含量進(jìn)行較好的控制，從而更好的保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1] Jeffrey MG，Britt S，Daniel AM.St John’s wort（Hypericum perforatum）：a review of the current pharmacological，toxicological，and clinical literature[J].Psychopharmacology，2001，153（2）：402.

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[3] 張慶建，趙毅民，楊明.黃酮類化合物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[J].中國中藥雜志，2001，26（8）：511-514.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：292.

[5] 陳奎發(fā).常用中草藥有效成分含量測定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：12.

[6] 國家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)站.植物藥有效成分手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：597，902.