食道癌中m iR-542-3p對Survivin基因的作用研究

蔡偉明 彭仕駿 呂文強 張志峰

（廣東省揭陽市人民醫(yī)院心胸外科，廣東揭陽 522000）

食道癌是世界上最常見的6大惡性腫瘤之一，在我國每年約有25萬新患者產(chǎn)生，其死亡率居惡性腫瘤的第4位。至今，已較成功的在分子水平上確認食道癌的致病基因，但如何對其進行基因治療仍是一大難題[1-2]。Survivin在人類各種腫瘤組織癌細胞中含量很豐富，但在正常細胞中卻幾乎不存在[3-4]。Survivin是一個142個氨基酸的蛋白，屬于一類防止細胞凋亡的蛋白質(zhì)。

microRNAs（miRNAs）是一個長度為21～25個核苷酸非編碼的小RNA家族，人類基因組編碼了超過1000個miRNA，通過干擾mRNA的翻譯而下調(diào)靶基因的表達。生物信息學數(shù)據(jù)表明，miRNA幾乎參與體內(nèi)所有的基本的信號傳導途徑，包括許多重要腫瘤相關基因的表達。研究表明，miRNA表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關，并已成功利用miRNA對腫瘤進行診斷、分期與生物治療。在現(xiàn)有的基礎上，通過對Survivin基因潛在的miRNA進行預測，挑取評分較高的miR-542-3p進行研究[5-8]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人食道癌細胞株KYSE-510由中國醫(yī)學科學院上海生命科學院贈送。細胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清（FBS）為PAA產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR擴增試劑盒和染料法定量試劑盒購自TaKaRa公司；miRNA mimics購自廣州銳博公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待貼壁生長后，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，進行傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天接種細胞于24孔板，第2天細胞匯合度達到75%時進行轉(zhuǎn)染，分為miR-542-3p過表達組（加入miRNA mimics）、正常對照組，每組重復3次，操作步驟按說明書進行，試劑用量按說明書的推薦用量而加。

1.4 染料法定量檢測Survivin基因的表達情況

轉(zhuǎn)染24h后，收集細胞提取RNA，染料法定量檢測Survivin基因的表達情況[9]，引物如下：F：5’-GGTTGTGAATGAGGCTTCTG-3’；R：5’-TGGCTTGCTGGTCTCTTC-3’，擴增長度為125bp。

內(nèi)參為GAPDH：F：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’；R：5’-ACTCCGACCTTCACCTTC-3’，擴增長度為97bp。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0軟件進行非參數(shù)一致性檢驗、秩和檢驗及x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 Survivin的表達與m iR-542-3p的關系

2 結果

將miRNA mimics組中Survivin相對表達水平的平均值設為1，與對照組相比，轉(zhuǎn)入miRNA模擬物組的Survivin的表達顯著降低（P＜0.01）。顯示miR-542-3p對Survivin具有明顯的負調(diào)控作用。見圖1。

3 討論

Survivin是由142個氨基酸構成的蛋白，僅含有單一的BIR功能區(qū)，沒有環(huán)指結構。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的新成員，在人類眾多惡性腫瘤中高表達，具有強烈的凋亡抑制功能和促細胞增殖活性，并與部分腫瘤的血管生成和預后有密切關系，因而已成為基因治療的熱門靶點。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多種轉(zhuǎn)化細胞系中表達，并見于所有人類最常見的腫瘤組織，包括肺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。

miRNA在不同組織不同發(fā)育階段的持續(xù)保守性表達具有廣泛的調(diào)控功能。miRNA調(diào)控基因表達的功能與來源無關，因此miRNA已經(jīng)成為重要的實驗工具。之前的研究表明食道癌細胞Survivin表達量會增多，在這一基礎上，為探討miRNA在腫瘤治療中的應用，本研究通過對靶向Survivin的miRNA進行研究，觀察其對Survivin的抑制作用。實驗證明miRNA能顯著抑制Survivin基因的表達，為其在腫瘤基因治療中的應用奠定了基礎。這一研究不僅加深了對食道癌分子機制的了解，而且說明Survivin可能會是治療食道癌潛在的靶點[10-13]。

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