AT1R及MCP-1基因多態(tài)性與腦梗死患者預后的相關性分析

常 升 王 銘 奚 志 白宏英 楊霄鵬△

1)鄭州市惠濟區(qū)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450053 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

老年人易患多種腦血管疾病，隨著中國人口老齡化的增加，發(fā)病率逐漸增加，尤其是腦梗死(CI)，發(fā)病率和病死率高。缺血性腦梗死的發(fā)作主要歸因于一系列血液循環(huán)障礙，導致腦缺血性壞死或腦組織軟化。一旦發(fā)生缺血性腦梗死，如未及時有效的治療，會迅速發(fā)展并造成嚴重后果[1-2]。CI是神經(jīng)內科常見的急危重病癥，是因顱腦局部血循環(huán)障礙引起，通常發(fā)病突然，病情危重，變化快，有著較高病死率和致殘率。腦梗死的病因涉及高血壓、糖尿病、高脂血癥、血管炎、動脈粥樣硬化和遺傳因素等。多種因素研究表明[3]，CI的病理生理變化較復雜，遺傳因素有著重要作用和影響。當前，臨床研究的CI有關候選基因已達到數(shù)十種。近年來，研究發(fā)現(xiàn)AT1R、MCP-1基因多態(tài)性會影響到血漿水平[4]，認為此種異常表達和缺血性心腦血管病有著密切關系。

血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對心血管和腎臟系統(tǒng)的病理生理至關重要[5]。過量會引起炎癥/氧化反應、高血壓、內皮功能障礙和血管重塑；各種研究表明，血管緊張素受體1亞型(AT1R)起介導的作用。AT1R基因表達的增加有助于高血壓和其他相關心腦血管異常的發(fā)作[6]。趨化因子在選擇性募集單核細胞，嗜中性粒細胞和淋巴細胞以及通過激活G蛋白偶聯(lián)受體誘導趨化性中起主要作用[7]。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是調節(jié)單核細胞/巨噬細胞遷移和浸潤的關鍵趨化因子之一[8]。MCP-1除了被認為是將單核細胞和巨噬細胞吸引到炎癥位點的有效介體外，還通過血腦屏障介導炎癥細胞的跨內皮遷移，并通過在體內形成趨化梯度來調節(jié)局部炎癥反應[9]。

但關于兩者和CI預后的相關性的研究報道還不多。本文應用PCR-RFLP技術測定AT1R及MCP-1基因多態(tài)性，并系統(tǒng)剖析與患者預后的相關性。

1 資料與方法

1．1一般資料以鄭州市惠濟區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內科2018-01—2019-10收治的145例CI患者作為研究對象，均經(jīng)臨床癥狀、輪腦影像學等檢查確診，符合CI的相關診斷標準[10]。臨床表現(xiàn)主要是頭痛、失語、偏癱、嘴角歪斜等。納入標準：(1)均為首發(fā)性缺血性CI，在發(fā)病后6 h內送院診治；(2)入院時GCS評分>8分，NIHSS評分<15分；(3)患者及家屬對研究知情并同意；(4)無用藥禁忌證。排除合并冠心病、肝腎功能不全、惡性腫瘤、凝血機制障礙、顱腦外傷及不接受隨訪等患者。其中男83例，女62例；年齡52～68(58.6±3.4)歲；發(fā)病到入院5～26(9.2±1.4) h。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準，且研究流程符合相關規(guī)范標準。

1．2方法

1．2．1 臨床治療：本組患者在確診后均給予專科對癥治療，包括行顱壓、抗血凝、吸氧、溶栓、改善側支循環(huán)、營養(yǎng)腦神經(jīng)等；同時，遵醫(yī)囑給用依達拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20031342)30 mg+0.9%氯化鈉溶液150 mL，靜注，30 min完成，2次/d，連續(xù)用藥14 d[11-12]。

1．2．2 基因多態(tài)性檢測：所有患者接受6個月隨訪，在末次隨訪抽取空腹12 h以上晨起外周肘靜脈血5 mL保存于EDTA抗凝血管待檢，通過低滲法將白細胞予以分離，再采用氯仿/異戊醇法完成DNA提取，待進行基因檢測。(1)AT1R A1166C，應用PCR-RFLP技術檢測，對于基因引物設計則參照相關文獻[13]，上游引物：5'-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3'，下游引物：5'-GAGATTGCATT TCTGTCAGT-3'，PCR擴增反應相關條件：于94 ℃下預變性2 min，94 ℃變性30 s，退火57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，經(jīng)過33個循環(huán)周期之后于72 ℃下延伸5 min，置于4 ℃恒溫下予以保存。加入5 U內切酶DdeI以及酶切緩沖液，置于37 ℃水中浴12 h酶切反應，應用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，予以溴化乙錠染色，再置于紫外燈下進行基因型的鑒定：如2個等位基因上均含內切酶識別位點，且在酶切后產(chǎn)生210 bp、140 bp的片段，則定為CC型；如在酶切之后產(chǎn)生350 bp、210 bp及p140 b的片段，則定義成AC；如不含概酶切位點，僅有350 bp片段，那么定義成AA型。(2)MCP-1 2518基因型。根據(jù)MCP-1 全DNA序列，以及有關文獻設計引物[13]，上游引物：5'-TCTCTCACGCCAGCACTGACC-3'，下游引物：5'-GAGTGTTCACATAGGCTTCTG-3'。PCR擴增反應條件：于95 ℃預變性5 min，再轉變成95 ℃變性40 s，退火至0 ℃ 30 s，然后72 ℃延伸40 s，經(jīng)過30個循環(huán)周期之后，再于72 ℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物置于自動凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增情況，以確定PCR產(chǎn)物是所需目的片段(234 bp)，再對目的片段實施限制性酶切：①基本條件：PvuⅡ內切酶1 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，去離子水7 μL，緩沖液2 μL，混合均勻后置于37 ℃水中水浴過夜；②基因分型：用2 μL上樣緩沖液溴酚藍與5 μL酶切產(chǎn)物混合均勻后，應用微量吸管把混合液加至凝膠槽孔內；③電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察確定基因型，僅顯示234 bp片段為AA型，顯示234 bp、159 bp及75 bp片段為GA型，顯示159 bp、75 bp片段為GG型。

1．3評價標準在隨訪6個月后，應用mRs量表評價患者預后，0～6分，無癥狀為0分；雖有癥狀，但無顯著殘障；輕度殘障3分；重度殘障4分，嚴重殘障為5分，6分為死亡。如評分≤1分為預后良好，>1分為預后不良。

1．4統(tǒng)計學處理將本課題研究資料統(tǒng)一錄入Excel進行整理，并應用SPSS 12.0 軟件包完成統(tǒng)計學分析，基因型、等位基因的頻率用%表示，行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1預后情況本組145例患者出院后均接受6個月隨訪，無失訪病例，通過mRs評分，預后良好90例，占62.07%，預后不良55例，占37.93%。

2．2預后良好和預后不良組AT1R基因多態(tài)性對比通過對AT1R A1166C基因檢測(圖1)，預后良好組患者AA、AC基因型頻率及C等位基因頻率分別為86.67%、23.33%、5.56%，分別低于預后不良組的45.45%、54.55%及24.55%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2．3預后良好和預后不良組MCP-1基因多態(tài)性對比通過對MCP-1 2518G/A基因檢測(圖2)，預后良好組的GG基因型頻率為27.78%、G等位基因頻率為43.33%，分別低于預后不良組的36.36%、54.55%(P<0.05)。見表2。

表1 預后良好和不良患者的AT1R基因多態(tài)性比較 (%)Table 1 Comparison of AT1R gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

表2 預后良好和不良患者的MCP-1基因多態(tài)性比較 (%)Table 2 Comparison of MCP-1 gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

圖1 AT1R PCR擴增產(chǎn)物內切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of AT1R PCR amplified products after endonuclease digestion

圖2 MCP-1 2518G/A的PCR產(chǎn)物酶切電泳圖Figure 2 PCR products of MCP-1 2518G/A digested by endonuclease and then electrophoretic

3 討論

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學在臨床研究中應用開來，及遺傳學技術、流行病學試驗等研究方法的應用，CI遺傳學的研究不斷深入。當前，用于分析人的基因突變和CI發(fā)生及預后的遺傳流行病學研究主要是關聯(lián)分析法，針對群體病例進行對比研究。人類基因組內的遺傳多態(tài)性大多數(shù)表現(xiàn)出重復序列和普遍性單核苷酸多態(tài)性(SNP)。所謂SNP就是在基因組內特定核苷酸所在位置存在的2種不同堿基置換，一般僅為1種二等位基因或二態(tài)遺傳變異，可通過自動化實現(xiàn)批量化檢測，與此同時，因在基因組中SNP的數(shù)量極大，分布密而有著很高的穩(wěn)定性，能夠為臨床提供豐富、多樣的基因遺傳變異信息，所以，將其作為新一代的基因遺傳標記。伴隨人類基因組計劃的不斷完善，學界日益重視基因組SNP，其可充分反應出不同群體、個體間的基因遺傳差異，并基于特定SNP研發(fā)和選用敏感藥物，以實現(xiàn)高度個體化的治療和干預，實現(xiàn)理想的治療效果和預后。

AT1R是一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要存在于血管平滑肌、心臟等組織內，在被血管緊張素II(Ang II)激活之后的效應主要在于平衡機體血壓與水電解質，機體持續(xù)性高血壓狀態(tài)會導致心腦血管形態(tài)學與生理功能發(fā)生改變[14]，如左室重塑、血管形態(tài)改變、內皮功能損害等。ATlR基因則位于人3號染色體長臂21～25區(qū)，A1166C則位于3’未翻譯區(qū)57端，A突變成C會出現(xiàn)這三種基因型：一是未突變純合子AA型；二是突變雜合子AC型；三是突變純合子CC型。此位點的突變不會導致其編碼氨基酸序列以及生理功能發(fā)生變化，但是可能會參與到基因的轉錄、翻譯的調控中，進而影響到AT1R對于Ang Ⅱ親和力改變。研究表明[15]，AT1R基本介導Ang Ⅱ所有臨床效應，會導致腦動脈、微動脈收縮效應，促進兒茶酚胺釋放，引發(fā)血管平滑肌細胞過度肥厚或增生，減小血管腔/壁比值，影響CI病情的改善。本研究中，對AT1R多態(tài)性與CI預后相關性開展研究，結果顯示CI預后良好患者的ATlR AA、AC基因型以及C等位基因的頻率整體高于預后不良患者(P<0.05)。由此表明，ATlR AA、AC基因型和CI預后有密切關系，與相關課題研究結論基本一致。

MCP-1會導致單核細胞與巨噬細胞的胞漿內游離Ca2+水平增高，表達粘附分子，釋放溶酶體酶以及超氧陰離子、組織因子以及促炎細胞因子，致單核/巨噬細胞激活和聚集，而加重血管腔內的脂質積累，促使動脈血管內膜組織細胞增生，加快動脈斑塊生長，引發(fā)CI，不利于病情改善。臨床上對MCP-1基因進行了諸多研究，但對其2518G/A多態(tài)性和動脈粥樣硬化、CI、心梗等缺血性心腦血管病變的預后間的相關性機制尚未完全明確。國外學者SKALNIAK 等[16]人研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1 2518G/A多態(tài)性血漿脂蛋白a(LP(a))的機體含量存在相關性。研究發(fā)現(xiàn)[17]，MCP-1 2518GG 基因型人群的LP(a)含量、患心腦血管病變的幾率均顯著高于MCP-1 2518AA基因型人群。高脂蛋白(a)血癥是動脈粥樣硬化、CI發(fā)生的主要危險因素。高脂蛋白(a)血癥和MCP-1 2518 GG基因型可能是通過提高MCP-1表達水平，增加白細胞聚集，進而增加動脈粥樣硬化損傷的危險性[18]。但有學者認為，也可能是通過促進脂質過氧化來導致動脈粥樣硬化損傷。研究認為[15-16]，MCP-1 2518G/A多態(tài)性可能通過影響MCP-1基因的轉錄、翻譯表達，來參與調控病癥發(fā)生發(fā)展中的炎性反應，最終對病癥的發(fā)生、發(fā)展、轉歸產(chǎn)生影響。有些刺激因素效用會誘導產(chǎn)生MCP-1的量表現(xiàn)出顯著的個體性差異，而MCP-1基因-2518G/A多態(tài)性會對此轉錄啟動區(qū)域的活性產(chǎn)生影響，并和單核細胞MCP-1的產(chǎn)量個體差異表現(xiàn)出一致性。臨床研究發(fā)現(xiàn)MCP-1 2518G/A多態(tài)性和血漿內的MCP-1水平表現(xiàn)出一定相關性，MCP-1 2518位點基因型為含G(GG，GA)者的血漿內MCP-1的整體水平要高于AA基因型者[19-20]。本研究顯示預后良好和預后不良患者相比，CI患者的MCP-1 2518位點有著較高的G等位基因攜帶頻率(GG，GA)，表明MCP-1 2518G等位基因可能是影響CI轉歸和預后的重要因素。由此推測，人體MCP-1基因2518G/A多態(tài)性和CI預后存在一定關系。

AT1R位點A1166C及MCP-1基因位點-2518多態(tài)性與CI的預后可能存在相關性，這為探索CI的治療和康復方案、方法的制定提供新的方向和思路。但是因本研究樣本量有限，使得某些基因型頻率整體較少，再加上缺乏區(qū)域性對比，會影響到結論的完整性和可靠性，因而，應加大樣本量，選取多區(qū)域病例進一步深入研究，以便充實和完善本課題的結論。