單純皰疹病毒1型US12基因siRNA篩選及其對(duì)病毒增殖的影響*

李 深， 任 哲，， 王巧利， 向陽飛， 王一飛△，胡巢鳳， 戚仁斌， 陸大祥△， 張庶民， 張佩琢

(暨南大學(xué)1生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東廣州510632; 3中國藥品生物制品檢定所，北京100050;4上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，上海201203)

單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV－1)是一種雙鏈DNA病毒，可引起口唇皰疹和皰疹型角膜結(jié)膜炎、單純皰疹病毒性腦炎等許多感染性疾?。?］。病毒感染后可長(zhǎng)期潛伏于人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，反復(fù)發(fā)作，給病人造成極大的痛苦與困擾［2］。雖然臨床上抗HSV病毒藥物種類繁多，但多為核苷類似物，毒副作用大，且存在停藥后易反彈、易產(chǎn)生耐藥突變株、不能完全抑制和清除潛伏的病毒等缺點(diǎn)。因此，尋找新的抗病毒治療策略，已成為當(dāng)今HSV感染后治療的研究熱點(diǎn)［3］。US12基因表達(dá)的立即早期蛋白ICP47所針對(duì)的是主要組織相容性復(fù)合體－I(major histocompatibility complexⅠ，MHC－Ⅰ)抗原呈遞過程中決定抗原呈遞效率的重要蛋白之一抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter of antigen peptides，TAP)。ICP47可以削弱TAP的肽轉(zhuǎn)運(yùn)功能，導(dǎo)致抗原遞呈細(xì)胞表面MHC－I的表達(dá)量顯著下降，直接干擾了MHC－I途徑對(duì)細(xì)胞毒T細(xì)胞的激活，使感染的細(xì)胞逃脫了宿主的免疫清除，在病毒感染中起著重要作用［4］。

RNA干擾(RNAi)是一種古老的生物抗病毒機(jī)制，是由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)［5］。RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗SARS、HIV、HBV病毒等的研究中，RNAi對(duì)RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒能通過發(fā)揮降解病毒基因組及降解靶基因表達(dá)的mRNA產(chǎn)生雙重抑制作用［6－9］。本實(shí)驗(yàn)以HSV－1病毒US12基因?yàn)檠芯繉?duì)象，篩選有效沉默的siRNA，體外研究其對(duì)HSV－1感染的作用，為進(jìn)一步應(yīng)用RNAi技術(shù)在抗病毒方面的研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Trizol試劑、M－MLV First Strand Kit逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen);SYBR Green PCR Master Mix、KOD－Plus高保真酶(Toyobo);限制性內(nèi)切酶Pst I和HindⅢ、T4DNA連接酶(TaKaRa);US12克隆及檢測(cè)引物、GAPDH檢測(cè)引物(上海生工);其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口。

US12克隆引物:上游引物5'－TATAAGCTTCCATGGTGATGTCGTGGGC－3'，下游引物5'－TACCTGCAGTGTACAACGGGTTACCGGA－3'。US12檢測(cè)引物:上游引物5'－TGGAAATGGCGGACACCT－3'，下游引物5'－GTTACCGGATTACGGGGACT－3'。

1.2 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒、菌種與培養(yǎng)基 pEGFP－N1質(zhì)粒、DH5α菌株、HSV－1(F株，ATCC VR733)、Vero細(xì)胞(ATCC CCL81)均為本實(shí)驗(yàn)室保存;轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基為OPTI－MEM無血清培養(yǎng)基(Invitrogen);細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10%胎牛血清(四季青)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基;細(xì)胞維持液為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3 siRNA設(shè)計(jì)與合成 從GenBank中獲取HSV－1F株US12基因mRNA序列，采用麻省理工學(xué)院在線siRNA設(shè)計(jì)工具搜尋潛在靶序列，并通過NCBI的BLAST Research考察潛在靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及同源性，最終得到3對(duì)siRNA。另設(shè)隨機(jī)的不靶向任何基因的siN.C作為陰性對(duì)照。序列(表1)提交上海吉瑪公司合成。siRNA干粉用DEPC水溶解后，得到濃度為40μmol/L的siRNA溶液。

表1 siRNA序列Table 1 .siRNA sequences

2 方法

2.1 pEGFP－N1－US12融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建HSV－1感染Vero細(xì)胞48 h后，Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增US12目的基因。反應(yīng)體系含10×KOD－Plus buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，2.5 mmol/L MgSO42.5 μL，10 μmol/L US12克隆引物上、下游引物各1.5 μL，cDNA 1μL，KOD－Plus 1 μL，DMSO 2.5 μL，無菌三蒸水30 μL。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收US12片段。US12片段Pst I和HindⅢ雙酶切后連接至pEGFP－N1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，挑選陽性克隆，重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定后，由Invitrogen公司測(cè)序。

2.2 pEGFP－N1－US12與siRNA共轉(zhuǎn)染 Vero細(xì)胞以1×106cells/well密度植入6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70% －80%，將pEGFP－N1－US12質(zhì)粒(4 μg/well)與siRNA(100 pmol/well)用LipofectamineTM2000按照產(chǎn)品說明書混勻并加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)siN.C作陰性對(duì)照組;37℃、5%CO2培養(yǎng)箱處理4h后，吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，PBS洗3遍后，加入DMEM生長(zhǎng)液。24 h后熒光倒置顯微鏡(Olympus CKX41)觀察融合蛋白表達(dá)情況，并用流式細(xì)胞儀(Bio－Rad)檢測(cè)每孔平均熒光強(qiáng)度(MFI)和熒光表達(dá)平均陽性細(xì)胞率α，計(jì)算細(xì)胞總熒光強(qiáng)度(TFI)，即TFI=10 000×MFI×α。與單轉(zhuǎn)質(zhì)粒對(duì)照孔細(xì)胞相比，定量分析每孔細(xì)胞US12－EGFP熒光相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(relative fluorescence intensity，RFI)，確定siRNA對(duì)目的基因表達(dá)的抑制效率。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)siRNA對(duì)感染細(xì)胞內(nèi)US12 mRNA表達(dá)水平的影響 Vero細(xì)胞以2×105cells/well的密度植入12孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%，轉(zhuǎn)染siRNA 80 pmol/ well，接種HSV－1病毒(1MOI)，12 h后，Trizol(Invitrogen)抽提總RNA，采用1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以US12檢測(cè)片段作為標(biāo)準(zhǔn)模板，從1010－103拷貝范圍作8個(gè)梯度稀釋，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品4個(gè)復(fù)孔。Choromo 4熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用SYBR Green I檢測(cè)。

2.4 空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn) Vero細(xì)胞以1.5×105cells/ well的密度植入24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%，轉(zhuǎn)染siRNA 80 pmol/well，轉(zhuǎn)染方法如上。4 h后，將25－30PFU/well的病毒感染細(xì)胞，37℃吸附;1.5 h后，棄病毒液，每孔加入1mL空斑覆蓋液(含有0.5%羧甲基纖維素的維持液)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，吸棄培養(yǎng)基，10%甲醛溶液固定 20 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，清水漂洗后，晾干，空斑計(jì)數(shù)。

結(jié)果

1 融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－N1－US12的鑒定

將PCR擴(kuò)增的US12基因片段連接在pEGFPN1載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pEGFP－N1－US12，對(duì)pEGFP－N1－US12質(zhì)粒和pEGFP－N1進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切鑒定結(jié)果如圖1，pEGFP－N1－US12有2條電泳帶約在4.7 kD和200 kD處，pEGFP－N1只有4.7 kD處1條條帶，這與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果證實(shí)目標(biāo)序列與US12 cDNA序列一致。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，熒光正常表達(dá)，說明pEGFP－N1－US12重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2 有效抑制HSV－1 US12基因siRNA篩選

共轉(zhuǎn)染24 h后，熒光倒置顯微鏡觀察(圖2)，siRNAS121和siRNAS122明顯抑制了熒光的表達(dá); siRNAS123一定程度抑制了熒光的表達(dá);陰性對(duì)照siN.C對(duì)熒光表達(dá)無可見影響。

Figure 1.Restriction enzyme digestion analysis for pEGFP－N1－US12.M:100bp Plus marker;lane 1:US12 fragment;lane 2:pEGFP－N1－US12 digested by Pst I and HindⅢ;lane 3:pEGFP－N1－US12 plasmid; lane 4:pEGFP－N1 digested by Pst I and HindⅢ.圖1 pEGFP－N1－US12雙酶切鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞總熒光強(qiáng)度。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染p－EGFP－N1－US12質(zhì)粒相比，siN.C陰性對(duì)照組無顯著差異，見圖3;siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123實(shí)驗(yàn)組與p－EGFP－N1－US12組熒光強(qiáng)度有顯著差異(P＜0.01)。siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123對(duì)US12基因的沉默效率分別為65.46%、66.26%和49.64%。

3 Real－time PCR檢測(cè)siRNA抑制感染細(xì)胞內(nèi)US12基因的表達(dá)

抽提病毒總RNA、逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)siRNA對(duì)感染細(xì)胞內(nèi)US12基因表達(dá)的影響。US12檢測(cè)引物與GAPDH檢測(cè)引物分別對(duì)cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，SYBR Green I摻入法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的產(chǎn)物量。Opticon Monitor 3軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2與斜率k符合理論值范圍，線性關(guān)系良好，可以作為準(zhǔn)確定量的依據(jù)。利用Opticon Monitor 3軟件計(jì)算起始模板量，siRNAS121、siRNAS122和siRNAS123對(duì)細(xì)胞內(nèi)US12基因表達(dá)抑制率分別為47.11%、67.47%和77.92%，與病毒對(duì)照組有顯著差異(P＜0.01)，見圖4。

4 siRNA對(duì)HSV－1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響

siRNA轉(zhuǎn)染4 h后，感染病毒72 h后甲醛固定，結(jié)晶紫染色后觀察空斑大小并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組的空斑形成數(shù)與病毒對(duì)照均無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。這表明所設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)病毒胞間復(fù)制沒有明顯影響。

Figure 2.Specific down－regulation of US12－EGFP expression by different siRNAs(×40).圖2 siRNA特異抑制US12－EGFP融合蛋白的表達(dá)

Figure 3.The relative expression of US12－EGFP protein after treatment with different siRNAs.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs pEGFP－N1－US12.圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)US12－EGFP融合蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度

Figure 4.The change of US12 gene expression after different treatment analyzed by real－time PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs V.V:virus control.圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)US12基因表達(dá)的影響

Figure 5.Plaques formed by HSV－1 in Vero cells treated with different siRNAs.±s.n=3.V:virus control.圖5 siRNA對(duì)HSV－1空斑形成數(shù)的影響

討論

HSV－1屬α皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒，基因組至少編碼70多個(gè)蛋白，按表達(dá)時(shí)序可分為α、β和γ 3類;可引起嚴(yán)重疾病如口唇皰疹、皰疹性腦炎、結(jié)膜炎、腦膜炎等，出現(xiàn)高熱、頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙等臨床癥狀、甚至造成死亡。立即早期基因US12編碼ICP47蛋白，由88個(gè)氨基酸組成。ICP47蛋白結(jié)構(gòu)中沒有構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件，且在水溶液中無特有的折疊構(gòu)象;但是ICP47自身具有膜結(jié)合能力，盡管該結(jié)合力比TAP存在時(shí)要弱約300倍，但是這種膜結(jié)合能力的存在很可能有利于ICP47局部濃度的提高，并且折疊成能有效結(jié)合TAP的構(gòu)象，成為ICP47與TAP高親和力結(jié)合的必要條件［11］。ICP47可以與TAP結(jié)合，削弱TAP的肽轉(zhuǎn)運(yùn)功能，導(dǎo)致空載MHC－I分子出現(xiàn)，干擾了MHC－I途徑對(duì)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的激活，使感染細(xì)胞逃脫了宿主的免疫清除，甚至成為病毒在體內(nèi)的儲(chǔ)備庫及傳播者。

RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗病毒研究中，對(duì)許多病毒尤其是RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒有較好的抗病毒效果，而對(duì)DNA病毒RNA干擾的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)室任哲等［10］構(gòu)建了人 HSV－1 UL40基因融合表達(dá)載體pEGFP－N1－UL40，并成功篩選出高效沉默人HSV－1 UL40基因的siRNA。朱欽昌等［12］利用所構(gòu)建的pEGFP－N1－gD融合表達(dá)載體篩選出高效沉默HSV－gD蛋白基因的siRNA并進(jìn)一步運(yùn)用于抗HSV－1的研究中。本文在任哲等工作的基礎(chǔ)上，針對(duì)HSV－1 UL12基因設(shè)計(jì)siRNA，研究干擾UL12基因?qū)SV－1病毒的影響。我們的結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的3對(duì)靶向UL12基因的siRNAs均能特異性沉默US12 mRNA的表達(dá)，但對(duì)HSV－1病毒空斑的形成沒有明顯影響。我們的結(jié)果表明，UL12基因與HSV－1病毒的體外增殖可能沒有直接的相關(guān)性。推測(cè)UL12作為HSV－1病毒免疫逃逸的關(guān)鍵基因，其編碼的ICP47蛋白主要通過參與體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)而影響病毒增殖。本研究針對(duì)特異性沉默UL12基因的siRNAs的成功篩選，為進(jìn)一步進(jìn)行干擾UL12基因體內(nèi)抗病毒研究提供了新的思路和有效的工具。

(致謝:感謝上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司對(duì)本研究的大力支持。)

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