飛行時間質(zhì)譜及其聯(lián)用技術在中藥領域中的應用*

馮金磊，何永志，史利利

飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）是一種很常用的質(zhì)譜。是所有質(zhì)譜儀中分析速度最快，質(zhì)量檢測范圍最寬，離子傳輸率最高的一種質(zhì)譜儀。這種質(zhì)譜的質(zhì)量分析器是一個離子漂移管，由離子源產(chǎn)生離子加速后進入無場漂移管，并以恒定的速度飛向離子接收器。這樣離子質(zhì)量越大，所到達接收器用的時間就越長，反之離子質(zhì)量越小，到達接收器所用時間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子按m/z值大小進行分離。它的優(yōu)點在于理論上對測定對象沒有質(zhì)量范圍限制、極快的響應速度以及較高的靈敏度。目前，TOF-MS技術已被廣泛應用于分析化學、生命科學、原子物理學及工藝過程監(jiān)控等諸多領域，成為近幾年來應用最廣的質(zhì)譜分析技術之一[1]。近些年來TOF-MS在分辨率上已有質(zhì)的飛躍（優(yōu)于104），然后再配合電噴霧基質(zhì)輔助激光解析電離/液相色譜及新型脈沖電噴霧等離子源，使之成為當今最有發(fā)展前景的質(zhì)譜儀[2]。筆者就飛行時間質(zhì)譜及其聯(lián)用技術在中藥方面的應用作一綜述。

1 中藥化學成分分析

中藥中的化學成分種類眾多、結(jié)構復雜，相當一部分成分穩(wěn)定性差，采用常規(guī)的分離鑒定技術難度較大。質(zhì)譜法是現(xiàn)有解決中藥復雜體系分離分析問題的最佳手段[3]。利用質(zhì)譜技術分析中藥化學成分一直是比較熱門的領域，包括皂苷類、生物堿類、黃酮類、酚酸、醇苷類等成分的分析研究，為進一步全面了解中藥有效成分和藥理奠定基礎。相比其他質(zhì)譜，飛行時間質(zhì)譜具有高分辨能力，能夠測得化合物的精確相對分子質(zhì)量。

劉劼等[4]采用高效液相色譜-電噴霧/飛行時間質(zhì)譜（HPLC-ESI/TOF-MS）聯(lián)用技術，研究4種丹參酮的分子結(jié)構與裂解規(guī)律間的關系，并對丹參酮中的脂溶性成分進行鑒定。通過與電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，獲得丹參中脂溶性成分的精確相對分子質(zhì)量和分子式，采用質(zhì)譜碰撞誘導解離技術獲得各化合物碎片的裂解信息，并對丹參中的16種丹參酮類化合物進行了初步鑒定。董靜等[5]采用高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜（HPLC/ESI-IT-TOF-MS）對蒽醌類以及羥基二苯乙烯類對照品，包括大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素和虎杖苷進行了分析，總結(jié)其多級裂解規(guī)律。建立了虎杖甲醇提取物的液相色譜分離條件及質(zhì)譜檢測條件，根據(jù)負離子模式下獲得的各組分多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對比對照品碎裂特征并參考文獻，對主要色譜峰進行指認，共鑒別了10個化合物。另外對藥材種類的鑒別也有一定優(yōu)勢。張國升等[6]采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法對蘆根進行測定分析，從中鑒定出4種甾體化合物結(jié)構，按峰面積歸一化法計算出甾族化合物成分在提取物中的相對含量為49.2%。該鑒定方法對藥物成分的結(jié)構分析和臨床用藥具有指導意義。由此可見TOF-MS是近年來發(fā)展起來的中藥有效成分定性定量分析的有力的工具，此方法便捷迅速能對化合物進行準確的分析鑒定。

2 中藥復方成分分析

中藥復方體系的成分分析是中藥現(xiàn)代化研究非常重要的部分。以往中藥復方成分鑒定主要采用色譜分離方法，這種方法需要經(jīng)過較復雜的分離、提取過程，比較費時，并且往往是針對某一類化合物的鑒定，難以完整系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥復方中多類別成分的復雜性。而質(zhì)譜法是現(xiàn)有解決中藥復雜體系分離分析問題的最佳手段，能夠?qū)崿F(xiàn)復雜成分的在線檢測和鑒定。

王勇等[7]采用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對蒙藥嘎日迪五味丸中的生物堿進行分析和鑒定。結(jié)果檢測到了雙酯型生物堿、單酯生物堿型和脂類生物堿共21種烏頭生物堿，為復方中藥中烏頭生物堿成分的分析提供了一種新的思路。曹陽[8]等究采用高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜（HPLC/TOF-MS）和高效液相色譜/離子阱多級質(zhì)譜（HPLC/IT/MS）的多維液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)篩查和鑒定中藥復方六神丸中的多類化學成分。對六神丸質(zhì)譜信息中的每個色譜峰進行了精確分子量測定，再結(jié)合離子阱質(zhì)譜提供的多級碎片結(jié)構信息對其進行結(jié)構解析，最后采用相應的標準品進行確證。共鑒定出六神丸中分別來源于蟾酥、麝香和牛黃3味藥材的25種化合物，為復雜體系的多類別成份分析提供了一種有效、可靠的新模式。陳曼等[9]建立了反相高效液相色譜分離、質(zhì)譜定性、紫外檢測定量測定康腎顆粒中葛根素含量的方法。用MALDI-TOF-MS分析鑒定對照品和樣品的餾分，在確定目標峰后進行紫外檢測定量測定。結(jié)果表明，葛根素在0.132～1.2g范圍內(nèi)其峰面積與進樣量呈良好的線性關系（r=0.999 7），平均加標回收率高于103%，相對標準偏差低于2.0%（n＝6）。應用該方法測定康腎顆粒中葛根素，其平均含量為3.09 mg/g。該方法簡單、快速、重現(xiàn)性好。

3 中藥的質(zhì)量控制

中藥所含的化學成分是其治療疾病的物質(zhì)基礎。中藥的真?zhèn)舞b別和中藥的質(zhì)量控制對于中藥的療效，乃至中藥走向世界都具有重要意義。近年來隨著質(zhì)譜聯(lián)用技術的成熟發(fā)展，為中藥化合物的定性定量分析提供了強有力的工具。其中基質(zhì)輔助激光解析電離—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是一種新的質(zhì)譜分析技術，已廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、寡糖等生物大分子的分析[10]。它除了具有傳統(tǒng)質(zhì)譜的靈敏度高、速度快的優(yōu)點外，可用于復雜體系中混合物的同時測定以及抗干擾能力強是其區(qū)別于傳統(tǒng)質(zhì)譜的重要特點。

潘愛華等[11]建立烏頭類中藥鑒別的基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法以龍膽酸（DHB）為基體，對不同種類的烏頭類中藥進行飛行時間質(zhì)譜分析，通過比較炮制烏頭與生烏頭質(zhì)譜指紋峰的差異，可作出烏頭類是否經(jīng)炮制的判斷。李坤平等[12]采用MALDI-TOF-MS分析玉屏風方的水煎煮和超聲提取物主要化學成分，通過質(zhì)譜獲得各組分的精確相對分子質(zhì)量和分子式，各組分精確相對分子質(zhì)量相同,并推定了10個化合物及其來源。得出玉屏風方水煎煮和超聲得到的提取物化學成分基本相同。袁湘林等[13]利用此技術以2，5-二羥基苯甲酸為基體對不同產(chǎn)地的黃芪進行質(zhì)譜分析，比較質(zhì)譜圖，找出黃芪的指紋峰，通過指紋峰和專屬性較強的質(zhì)譜峰判斷黃芪的真?zhèn)?，判斷出蘭州產(chǎn)紅芪不是黃芪。殷月芬等[14]用高效液相色譜-高分辨電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術，對蟾酥中的部分有效成分進行初步分析，通過HPLC-ESI/TOF-MS在線測定部分化合物的精確分子量，結(jié)合文獻報道，對蟾酥毒素進行鑒別。結(jié)合文獻報道，在色譜峰當中對12個主要色譜峰進行鑒定。

4 藥物活性篩選

生物色譜技術是近年來興起的一種研究方法并成功用于篩選當歸、川芎等中藥中的活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，中藥發(fā)揮作用的一個重要步驟是與靶細胞或細胞內(nèi)特異性的酶或受體結(jié)合。因此，與靶細胞有結(jié)合的藥物成分可能為藥物的活性成分[15-16]。研究與靶細胞有結(jié)合的成分有助于藥物活性成分的篩選及藥效機制的研究。

祝艷斐等[17]應用內(nèi)皮細胞作為靶細胞，中藥提取液中的活性成分可選擇性地與其結(jié)合，洗去未結(jié)合的成分，用HPLC-ESI/TOF-MS對細胞解離液中的成分進行分析。結(jié)果從玄參提取液中檢測出6個可與內(nèi)皮細胞結(jié)合的成分，其中3個鑒定為安格洛苷 C（angoroside C）、肉桂酸（cinnamic acid）和哈巴俄苷（harpagoside）。本方法可用于預測中藥中與內(nèi)皮細胞相結(jié)合的活性成分。張溪等[18]利用HPLC-ESI/TOF-MS分析中藥黃芪提取液分別與Caco-2細胞和紅細胞有結(jié)合的成分，并對其進行結(jié)構鑒定。結(jié)果顯示黃芪中有10個化合物與Caco-2細胞結(jié)合，14個化合物與紅細胞結(jié)合。本方法可用于預測口服藥物在體內(nèi)的吸收以及與特定靶細胞的結(jié)合情況，特異性地篩選中藥復雜體系中的藥效物質(zhì)基礎。

5 其他方面

TOF-MS在體內(nèi)藥物代謝分析研究領域中也有所應用。近年來由于質(zhì)譜聯(lián)用技術的迅猛發(fā)展，使得目前質(zhì)譜已成為中藥代謝物研究和檢測的重要工具。汪江山等[19]建立了一種基于超高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜（UPLC/TOF-MS）測定人參皂苷Rg3給藥后大鼠尿液代謝物變化的方法，對其中2種發(fā)生顯著變化的代謝物分別通過準確的質(zhì)量測定得到其元素組成，通過MS/MS技術得到其結(jié)構信息。趙新峰等[20]采用UFLC-ESI-IT-TOF方法在六味地黃丸提取物中鑒定了40種化學成分，在大鼠血中鑒定了6種原型藥物和9種代謝產(chǎn)物，并推斷了以上產(chǎn)物的代謝途徑。

蛋白質(zhì)組學是近年來興起的一門新學科，其主要技術為雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析技術、同位素標記親和標簽技術等，它將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一。王若光等[21]以蛋白質(zhì)芯片為地龍蛋白質(zhì)/肽相互作用載體，SELDI-TOF-MS精確計數(shù)相對分子質(zhì)量，從蛋白質(zhì)組學角度對地龍生干品和炮制品進行了分析，初步獲取了兩者所含蛋白質(zhì)/肽成分信息，為進一步分離純化地龍活性蛋白質(zhì)/肽單體奠定基礎。

6 總結(jié)與展望

飛行時間質(zhì)譜質(zhì)量范圍寬，分析速度快，無需掃描，能夠在幾微秒至幾十微秒時間內(nèi)實現(xiàn)全譜分析，離子的傳輸效率能夠達到100%。近年來隨著國際上對生物化學、基因蛋白質(zhì)工程和生物制藥等領域的不斷深入，作為在該領域中重要的分析研究工具飛行時間質(zhì)譜儀（TOF-MS）以它微秒級的快速檢測速度、高離子傳輸率、高靈敏度和精度、以及理論上無質(zhì)量檢測上限等眾多優(yōu)點逐漸成為質(zhì)譜儀中發(fā)展最為迅猛的儀器。因此飛行時間質(zhì)譜在藥物分析、工業(yè)檢測特別是在生物工程領域內(nèi)發(fā)揮著不可替代的作用[22]。縱觀TOF-MS的發(fā)展歷程，離子源技術和聯(lián)用技術對其發(fā)展起到了主要的推動作用。新的電離技術的發(fā)展不斷地拓展飛行時間質(zhì)譜的應用范圍，因此開發(fā)新型電離源將是飛行時間質(zhì)譜研究中不斷探索的目標[23]。為了進一步提高靈敏度或分辨率，與氣相色譜、液相色譜、電泳、離子阱及其他質(zhì)譜聯(lián)用用于復雜體系分離分析等技術將成為研究和應用的熱點。

[1]呂 亮，曹建濤.飛行時間質(zhì)譜分析技術進展[J].廣州化工，2009，37（8）：49-51.

[2]Piyadasa CKG，Hakansson P，Ariyaratne TR.Rapid Commun[J].Mass Spectrom，1999，13(7)：620-624.

[3]邵清松，胡潤淮.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在中藥研究中的應用[J].中醫(yī)藥學，2007，35（3）：44-47.

[4]劉 劼，楊黃浩，黎先春，等.高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜分析丹參中的丹參酮類化合物[J].質(zhì)譜學報，2008，29（5）：261-267.

[5]董 靜，王 宏，萬樂人，等.高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜分析鑒定虎杖中的主要化學成分[J].色譜，2009，27（4）：425-430.

[6]張國升，李前榮，尹 浩，等.蘆根中甾體的GC-TOF-MS鑒定[J].安徽中醫(yī)學院學報，2005，24（3）：40-42.

[7]王 勇，夏 博，鄧曉春，等.蒙藥嘎日迪五昧丸中二萜生物堿的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學報，2009，30（2）：78-82.

[8]曹 陽，梁瓊麟，章弘揚，等.中藥復方六神丸中多類成分的多維液質(zhì)系統(tǒng)篩查和鑒定[J].分析化學，2008，36（1）：39-46.

[9]陳 曼，史 鍵，王驪麗，等.反相高效液相色譜法測定康腎顆粒中的葛根素[J].色譜，2006,24（5）：489-491.

[10]Karas M，Hilencamp F.Laser desorption.ionization of proteins with molecular masses exceeding 10 000 daltons[J].Anal Chem，1988，60(12)：2299.

[11]潘愛華，劉 捷.基體輔助激光解吸電離飛行時問質(zhì)譜鑒別烏頭的研究[J].法醫(yī)學雜志，2005，21（2）：118-120.

[12]李坤平，高崇凱，李衛(wèi)民.超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析玉屏風方水煎煮和超聲提取物[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：1836-1840.

[13]袁湘林，張玉奎，鄒漢法.基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜用于中草藥黃芪鑒別的研究[J].藥物分析雜志，2001，21（1）：7-9.

[14]殷月芬，張曉理，陳軍輝，等.高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜分析蟾酥有效成分[J].中國藥學雜志，2009，44（8）：623-627.

[15]李 萍，齊煉文，聞曉東，等.中藥效應物質(zhì)基礎和質(zhì)量控制研究的思路與方法[J].中國天然藥物，2007，5（1）：3-9.

[16]Wainer W,Kaliszan R,Noctor TA.Biochromatography using immobilized biopolymers:a new approach to the determinati on of pharmacological properties[J].Pharm Pharmacol,1993， 45(Supp l)：367-373.

[17]祝艷斐，畢志明，劉承偉，等.內(nèi)皮細胞提取和高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用預測玄參中的活性成分[J].中國藥科大學學報，2008，39（3）：228-231.

[18]張 溪，齊煉文，李 萍，等.體外細胞模型和高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分析預測黃芪中的活性成分[J].分析化學，2008，36（6）：745-749.

[19]汪江山，趙欣捷，鄭育芳，等.超高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜用于人參皂苷Rg 3作用后大鼠尿液代謝物指紋圖譜分析及標記物的鑒定[J].色譜，2006，24（1）：5-9.

[20]趙新峰，孔宏偉，汪江山，等.UFLC-ESI-IT-TOF鑒定六味地黃丸中化學成分和代謝成分[J].中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（1）：153-157.

[21]王若光，李春梅，王陸穎，等.以蛋白質(zhì)芯片為中藥蛋白質(zhì)/肽相互作用載體分析中藥地龍生干品和炮制品的生物學特征[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（12）：2489-2492.

[22]賈韋韜，徐國賓，姚 均，等.高效液相色譜檢測器-飛行時間質(zhì)譜的研制[J].質(zhì)譜學報，2004，5（增刊）：209-210.

[23]侯可勇，董 璨，王俊德，等.飛行時間質(zhì)譜儀新技術的進展及應用[J].化學進展，2007，19（3）：385-392.