灰樹花母種培養(yǎng)基的篩選及不同碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響

孟翔鵬，馬 琳，呂斯琦，孫 靜

灰樹花（Grifola frondosa）又名栗（子）蘑、貝葉多孔菌、蓮花菌、千（手）佛菌、云蕈、舞茸等。在分類學(xué)上隸屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬。是近年來開發(fā)的珍奇藥食兩用菌之一，灰樹花因其均衡豐富的營養(yǎng)價(jià)值，顯著的醫(yī)療保健作用，而被譽(yù)為“食用菌王”，是極具發(fā)展前景的高檔食用菌。中國、歐美、日本等許多國家對(duì)灰樹花藥理作用的研究表明，灰樹花具有抗艾滋病病毒、抗癌、提高機(jī)體免疫、降血糖、刺激骨細(xì)胞生長和修復(fù)等多種藥理活性[1-5]。筆者對(duì)不同母種培養(yǎng)基上灰樹花菌絲的生長情況以及不同碳、氮源對(duì)灰樹花菌絲生長的影響進(jìn)行分析比較，優(yōu)選出適宜菌種擴(kuò)種繁殖的培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)所需碳源、氮源等營養(yǎng)條件。

1 材料與儀器

1.1 菌種 灰樹花（Grifola frondosa）購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.2 試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸氨（NH4NO3）、氯化氨（NH4Cl）、硝酸鈉（NaNO3）、亞硝酸鈉（NaNO2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4）、瓊脂均為國產(chǎn)分析純；馬鈴薯、麥麩、玉米粉為食品級(jí)。

1.3 儀器 CLIN-250C型生化培養(yǎng)箱（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JB-CJ-2FXS潔凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；YXQ-LS-SⅡ型高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；YS2-H Nikon生物顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；AB204N萬分之一電子天平（上海精密儀器有限公司）；DSC-W570型數(shù)碼照相機(jī)（索尼數(shù)字產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1 供試培養(yǎng)基

2.1.1 試管母種培養(yǎng)基 配方A（g/L）：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；配方 B（g/L）：綜合 PDA 培養(yǎng)基[7]；配方 C（g/L）：玉米粉 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 D（g/L）：麥麩 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 E（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨6，酵母粉 2，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 F（g/L）：板栗木屑 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方G（g/L）：馬鈴薯 200，板栗木屑 200，瓊脂 20，水1 000 mL；配方 H（g/L）：馬鈴薯 200，麥麩 100，瓊脂20，水 1 000 mL；配方 I（g/L）：葡萄糖 20，硝酸銨 4，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0.5，瓊脂20，水1 000 mL。

2.1.2 母種平板培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，瓊脂20，水1 000 mL；以上培養(yǎng)基pH值約為6.0。

2.2 平板培養(yǎng)基碳源實(shí)驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為2g/L的蛋白胨，再分別添加20g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、陽性對(duì)照（PDA）和空白對(duì)照（不加碳源），制成平板，無菌接種0.5 cm2大小的菌絲塊，25℃黑暗培養(yǎng)，觀測其生長狀態(tài)。

2.3 平板培養(yǎng)基氮源實(shí)驗(yàn) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為20g/L的蔗糖，再分別添加蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2，空白（不加氮源）為對(duì)照，制成平板，其余操作同上。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將優(yōu)選出的碳源和氮源組合成新的培養(yǎng)基，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按上述操作，觀測其生長狀態(tài)，以上各組分別做5次重復(fù)。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 菌絲日生長速度（mm/d）=菌落平均半徑（mm）/生長天數(shù)（d），實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 灰樹花菌絲在9種不同的母種試管培養(yǎng)基上的生長情況 菌絲在9種試管培養(yǎng)基中均能生長，但表現(xiàn)各有差異，結(jié)果見表1。

表1 菌絲在9種不同的母種試管培養(yǎng)基上的生長情況

衡量菌種質(zhì)量優(yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo)是菌絲長勢強(qiáng)弱和生長速度（滿管時(shí)間）?；覙浠ňz長勢特征中，菌落形態(tài)完整、色澤潔白、密度濃密、氣生菌絲量中等、菌絲粗壯、分支較多、可見鎖狀聯(lián)合等特征為菌種優(yōu)良特征，符合以上特征的培養(yǎng)基為灰樹花最佳篩選培養(yǎng)基[8]。由表1可見，培養(yǎng)基C滿管時(shí)間最短，但是菌絲色澤為淡紅棕色，表明老化嚴(yán)重，不利于其作為后續(xù)液體發(fā)酵或栽培的母種使用，棄去不選。培養(yǎng)基B滿管時(shí)間為18 d，除了C之外，為生長速度最快的。除了未觀察到鎖狀聯(lián)合之外，其他特征均符合優(yōu)良菌種特征，因此，選擇B配方，即綜合PDA培養(yǎng)基為灰樹花母種最佳培養(yǎng)基。

3.2 不同碳源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長的影響灰樹花菌絲在5種碳源平板培養(yǎng)基中均能生長，但表現(xiàn)各有差異，結(jié)果見表2。果糖作為碳源時(shí)，菌絲生長速度最快，與陽性對(duì)照（PDA）沒有差異，平均日生長速度為2.46 mm/d，其次依次為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖。果糖與葡萄糖相比，差異有極顯著意義，因此選擇果糖作為最佳碳源。

表2 不同碳源對(duì)灰樹花菌絲生長的影響

3.3 不同氮源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長的影響由表3可以看出，灰樹花菌絲利用氮源的能力不盡相同，對(duì)有機(jī)氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母粉）的利用能力顯著高于無機(jī)氮源，最適氮源為牛肉膏，菌絲日均生長速度2.09 mm/d，其次為生長速度沒有顯著差異的蛋白胨和酵母粉；無機(jī)氮源中，利用銨態(tài)氮（NH4Cl和NH4NO3）的能力明顯高于硝態(tài)氮（NaNO2和NaNO3），相比較差異具有顯著性。

表3 不同氮源對(duì)灰樹花菌絲生長的影響

3.4 最優(yōu)碳、氮源對(duì)平板培養(yǎng)基中菌絲生長的影響 灰樹花菌絲在由果糖和牛肉膏組成的最優(yōu)培養(yǎng)基中無論菌絲生長速度還是長勢，均表現(xiàn)良好：菌絲日均生長速度為3.0 mm/d，菌落形態(tài)完整，菌絲潔白，密度為++++，菌落較厚。

4 討論

通過灰樹花母種培養(yǎng)基配方的研究，結(jié)果表明：不同配方的培養(yǎng)基對(duì)灰樹花菌絲生長速度以及長勢都有較大影響，在供試的9種不同母種培養(yǎng)基中，篩選出最適合灰樹花母種生長的培養(yǎng)基是B配方，即PDA綜合培養(yǎng)基，滿管時(shí)間短、生長速度快、長勢強(qiáng)且不易老化。通過灰樹花平板培養(yǎng)基碳、氮源篩選的研究，結(jié)果表明：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖都可以作為灰樹花菌絲生長的碳源，但對(duì)菌絲生長速度和長勢表現(xiàn)有所不同，以果糖為碳源時(shí)日均生長速度最快（2.46 mm/d），菌落完整、菌絲潔白、密度最厚，為最佳碳源。蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2作為氮源時(shí)，對(duì)灰樹花菌絲生長速度和長勢表現(xiàn)有所差異，以有機(jī)氮源最好，其中牛肉膏為氮源時(shí)日均生長速度最快（2.09 mm/d），菌落完整、菌絲潔白、密度較厚為最佳氮源，無機(jī)氮源利用較差，其中以銨態(tài)氮為氮源明顯好于硝態(tài)氮。在以篩選出的最佳碳源（果糖）和最佳氮源（牛肉膏）組合成的新的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果表明：菌絲長勢良好，日均生長速度為3.0 mm/d，快于實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2中以果糖為碳源時(shí)的速度（2.46 mm/d），也快于實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3中以牛肉膏為氮源時(shí)的速度（2.09 mm/d）。

從差異顯著性上來說，有碳源組明顯優(yōu)于無碳源組；果糖組明顯優(yōu)于其他碳源組，原因可能是果糖在分子結(jié)構(gòu)上是一種酮糖，而葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖都含有葡萄糖分子，即都含有醛糖結(jié)構(gòu)，灰樹花體內(nèi)代謝的酮糖酶多于醛糖酶，導(dǎo)致利用含有酮糖結(jié)構(gòu)的碳源速度較快。另外一個(gè)原因可能是由于在步驟2.2碳源實(shí)驗(yàn)中20g/L的果糖與2g/L的蛋白胨的碳/氮（C/N）相比其他4種糖的C/N更接近灰樹花最適C/N。

[1]Hiroaki Nanba,Noriko Kodama,Douglas Schar.Effect of Maitake(Grifolafrondosa)glucanin HIV-infected patients[J].Mycoscience,2000,41(2):293-295.

[2]Yuki Masuda,Noriko Kodama,Hiroaki Nanba.Macrophage J774.1cellisactivatedbyMZ-Fraction(Klasma-MZ)polysaccharide in Grifola frondosa[J].Mycoscience,2006,47(3):360-366.

[3]李?；?灰樹花多糖的免疫作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（2）：365－366.

[4]周 偉，奚清麗，石根勇.灰樹花多糖對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，20（4）：17－20.

[5]Ashraf Saif,Ulrike Lindequist,Kristian Wende.Stimulating effects of Grifola frondosa on human osteoblastic cell cultures[J].J Nat Med,2007,61(1):231-238.