類肝細(xì)胞的研究進(jìn)展

龔慧賓，張全勝 綜述，沈中陽，宋紅麗 審校

（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津300192）

肝臟是體內(nèi)最重要、最復(fù)雜的器官之一，既是機(jī)體物質(zhì)代謝的核心，還具有生物轉(zhuǎn)化、排泄膽汁和免疫等重要功能；肝臟同時也是一個極易受損傷的器官，代謝途徑的障礙、病毒感染、毒性物質(zhì)及腫瘤會導(dǎo)致肝臟功能的不可代償性缺損甚至累及生命。隨著肝移植的研究發(fā)展，肝細(xì)胞移植有望成為從根本上治療肝功能衰竭的一種新方法。肝細(xì)胞的來源問題逐漸成為關(guān)注和研究的熱點(diǎn)，干細(xì)胞分化來源的類肝細(xì)胞的研究成為解決肝細(xì)胞來源的關(guān)鍵點(diǎn)。近年來研究表明，在適宜的微環(huán)境下，骨髓干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞均可以跨越胚層向內(nèi)胚層起源的肝細(xì)胞分化，分化成具有肝細(xì)胞形態(tài)、表型和肝細(xì)胞功能特征的類肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞（heatocyte-like cell）[1]。本文就間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)和體外如何分化成類肝樣細(xì)胞方法及類肝細(xì)胞所具有的特點(diǎn)、應(yīng)用前景做一綜述。

1 體外實(shí)驗(yàn)研究

2000年11月，日本學(xué)者[2]通過骨髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)，采用肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)誘導(dǎo)，首先在體外觀察了HGF對骨髓細(xì)胞向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用。他們通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓細(xì)胞中存在表達(dá)甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和c-met(HGF受體)的類肝細(xì)胞，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)這些類肝細(xì)胞還可表達(dá)細(xì)胞角蛋白CK-8和CK-18。因此他們認(rèn)為，骨髓中可能包含一些表達(dá)AFP的肝臟祖細(xì)胞，這些細(xì)胞在HGF的誘導(dǎo)下可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Miyazkai等[3]將鼠骨髓細(xì)胞在含HGF和表皮生長因子(epdiemral growth fator,EGF)的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)4個月內(nèi)肝細(xì)胞樣細(xì)胞可擴(kuò)增1000倍，通過RT-PCR和免疫組化可檢測出白蛋白、AFP、Thy-1和Kit等的表達(dá)。Fiegel等[4]體外培養(yǎng)成人骨髓干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在28d后CD34+細(xì)胞表達(dá)白蛋白RNA和CK-19RNA，CD34+細(xì)胞顯示肝特異性的基因表達(dá)，該結(jié)果提示CD34+成人骨髓細(xì)胞能在體外分化成類肝細(xì)胞。

Awiatl等[5]用HGF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)由骨髓分離出來的b2m-/Thy21+骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)后的細(xì)胞具備肝細(xì)胞表面標(biāo)志物，并具備肝細(xì)胞部分功能，如能合成尿素和白蛋白。國內(nèi)李文晰等[6]通過HGF、纖維細(xì)胞生長因子-4(FGF-4)體外誘導(dǎo)人骨髓單個核細(xì)胞向類肝細(xì)胞分化，從肝系表型和功能兩方面進(jìn)行檢測，結(jié)果提示了類肝細(xì)胞標(biāo)志物逐漸出現(xiàn)和成熟。楊明智等[7]將大鼠骨髓干細(xì)胞分離后分別在不同濃度HGF、EGF組合進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，20d后通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到CK-8和CK-18和白蛋白，RTPCR擴(kuò)增出AFP和白蛋白的mRNA。2002年，Schwartz等[8]報(bào)道，分別將正常大鼠、小鼠和人的骨髓多能成體祖細(xì)胞 (multi-potent adult progenitor cells，MAPC)接種到鋪有基質(zhì)明膠的培養(yǎng)瓶中，并加入HGF和FGF-4，培養(yǎng)的第7天，MAPC分化成上皮樣細(xì)胞，并表達(dá)AFP、肝細(xì)胞核因子-3β(hepatocyte nuclear factor-3β，HNF-3β)、GATA4、CK19、甲狀腺激素結(jié)合蛋白；第14～18天期間，表達(dá)CK-18、HNF-4，在21d后，其中25%的細(xì)胞CK18和白蛋白染色呈陽性；功能方面的檢測，這些上皮樣細(xì)胞具有肝細(xì)胞的功能特征：分泌尿素和白蛋白，攝取低密度脂蛋白并有儲備糖原功能。結(jié)果提示體外MAPC在傳了100代后仍能保持未分化狀態(tài)，且經(jīng)HGF和FGF-4的誘導(dǎo)可分化為具有形態(tài)、表型和功能特性的肝細(xì)胞。2003年，Kumoto等[9]用陰性選擇磁場細(xì)胞分離系統(tǒng)得到豐富的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別采用共培養(yǎng)法和生長因子誘導(dǎo)法進(jìn)行誘導(dǎo)分化，一組將骨髓干細(xì)胞與正常肝細(xì)胞培養(yǎng)，另一組則用20ng/mL HGF誘導(dǎo)培養(yǎng)，兩組實(shí)驗(yàn)在3d后經(jīng)RT-PCR均檢測出肝細(xì)胞的特異性標(biāo)記，如HNF-h和CK-18，第7天表達(dá)AFP和ALB。兩組實(shí)驗(yàn)在不同條件培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能檢測出Notch-1受體和配體Jagged-1的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Notch受體-1的表達(dá)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為類肝細(xì)胞的機(jī)制中起了非常重要的作用。國內(nèi)何念海等[10]用胎鼠骨髓來源的骨髓干細(xì)胞體外用乙酰唑胺（acetazolamide，AZA）預(yù)處理后培養(yǎng)于Matrigel包被并加用FGF-4和HGF的HGM中培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)后的骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生尿素和白蛋白，并含有糖原顆粒，不僅表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志，更有與肝細(xì)胞代謝活性一致的功能特征。2004年，Lee等[11]采用兩步法誘導(dǎo)方案，將骨髓和臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離后，用96孔板進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，并接種于含20ng/mL EGF和10ng/mL FGF的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d，第3天加入0.61g/L煙酰胺，培養(yǎng)7d后改為含20ng/mL制瘤素M、1mol/L地塞米松、50mg/mL ITS+1等誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)方法,在誘導(dǎo)的不同階段，細(xì)胞表現(xiàn)出肝細(xì)胞功能的各種特征：（1）細(xì)胞形態(tài)的變化:第2周時細(xì)胞由原來的長梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛渭?xì)胞的多角形。（2）細(xì)胞表型及標(biāo)志物：第2周開始表達(dá)AFP、Alb、CK-18并儲備肝糖原。（3）具有類肝細(xì)胞的功能：4周后具有攝取低密度脂蛋白能力、表達(dá)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶和能誘導(dǎo)苯巴比妥活性的細(xì)胞色素P450。在誘導(dǎo)6周后開始分泌尿素，同時表達(dá)細(xì)胞核因子-4（HNF-4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人類不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后可成為具有肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞。同年Jiang等[12]利用共培養(yǎng)方法，將雄性正常大鼠Fr251in-PKH+HSC與雌性CCL4肝損傷大鼠的肝組織液置于培養(yǎng)槽中共同培養(yǎng)，數(shù)小時后造血干細(xì)胞（haemopoietic stem cell，HSC）表面抗原CD45逐漸減弱；第24h后HSC表達(dá)肝轉(zhuǎn)錄因子(包括AFP、GATA-4、HNF-4、HNF-3β、HNF1α、C/EBPA)和成熟肝細(xì)胞標(biāo)記(CK-18、、纖維蛋白原和轉(zhuǎn)鐵蛋白)；并利用FISH技術(shù)分析其中四倍體核型，發(fā)現(xiàn)只有XYXY核型，并無XXXY核型；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSC參與受損肝臟修復(fù)，并排除HSC和肝細(xì)胞融合的可能。2007年，Sarah等[13]根據(jù)肝胚胎發(fā)生時的細(xì)胞因子分泌,序貫給予細(xì)胞因子FGF-4、HGF、HGF和ITS+1以及地塞米松誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向類肝細(xì)胞細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，細(xì)胞分化為具有分泌AFP、白蛋白功能的一類細(xì)胞，并有尿素的分泌功能，PAS糖原染色陽性，表達(dá)細(xì)胞因子CK-18。加入TSA能顯著增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類肝細(xì)胞分化。2008年，ZHAO等[14]采用酶學(xué)法從臍帶全層組織中分離臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，采用兩階段法誘導(dǎo)：第一階段培養(yǎng)采用補(bǔ)充50ng/mL HGF、10ng/mL bFGF培養(yǎng)體系持續(xù)14d，接下來第二階段采用D/F12加入20ng/mL致瘤素M、1mol/L地塞米松、50mg/mL ITS+1premix培養(yǎng)體系持續(xù)培養(yǎng)14d。體外誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向類肝細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后14d、28d，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測AFP、白蛋白；RT-PCR檢測肝細(xì)胞標(biāo)志性基因AFP、ALB和CK-19mRNA。ELISA法檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白水平。流式細(xì)胞儀檢測誘后細(xì)胞白細(xì)胞表面抗原HLA2-Ⅰ和HLA2-Ⅱ。實(shí)驗(yàn)證實(shí)從人臍帶基質(zhì)中分離培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在向類肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系的培養(yǎng)下,細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸轉(zhuǎn)化成為多角形或類圓形,并且表達(dá)AFP、ALBmRNA和白蛋白,并且誘導(dǎo)后的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞以時間依賴方式產(chǎn)生ALB，誘導(dǎo)后的細(xì)胞不表達(dá)HLA-DR，證實(shí)誘導(dǎo)分化后的類肝細(xì)胞仍具有低免疫原性。綜上所述，間充質(zhì)干細(xì)胞主要是在細(xì)胞因子HGF、bFGF、致瘤素M、地塞米松、ITS+1的刺激下，誘導(dǎo)向類肝細(xì)胞的橫向分化，首先是先分化為肝前體細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞分化的早期標(biāo)志GATA4、CK-19和AFP，再分化為成熟肝細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞的晚期標(biāo)志HNF1-α、HNF-3β、CK-18和ALB，分化后的類肝細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài)、表型及標(biāo)志物，并具備一定肝細(xì)胞功能。

2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

1999年P(guān)etersen[15]報(bào)道，雄性大鼠的造血干細(xì)胞移植給雌性大鼠，1周后相繼在受體非實(shí)質(zhì)性和實(shí)質(zhì)性肝細(xì)胞中檢測到來自供體Y染色體的特異性基因。研究者將二肽肽酶陽性（DPPTV）的雄性大鼠骨髓移植給肝衰模型的雌性大鼠，同樣也在受體肝細(xì)胞中檢測到DPPTV的信號，提示供體造血細(xì)胞參與受體肝細(xì)胞再生。這是有關(guān)HSC分化為類肝細(xì)胞的最早報(bào)道，引發(fā)了人們的關(guān)注。Theise[16]通過相似的方法，將雄性小鼠的骨髓移植到同系雌性小鼠體內(nèi)，通過ALBmRNA和Y染色體雙染FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)雄性小鼠骨髓干細(xì)胞會在雌性小鼠體內(nèi)分化為成熟的肝細(xì)胞。Theies[17]和Aliosn[18]還發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)同樣存在上述情況。Lagass等[19]在FAH缺陷大鼠模型中證實(shí)，純化造血干細(xì)胞能在肝臟內(nèi)分化為功能完備的肝細(xì)胞。國內(nèi)展玉濤等[20]發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞可以在大鼠肝纖維化的環(huán)境下向肝細(xì)胞分化，首先利用四氯化碳（CCL4）造成大鼠肝纖維化模型，然后用流式細(xì)胞儀分選了富含Thy+CD3-CD45-RA的骨髓干細(xì)胞，利用紅色熒光燃料標(biāo)記后自體移植，發(fā)現(xiàn)約占肝細(xì)胞總數(shù)的（0.17±0.002）%的骨髓干細(xì)胞分化成具有功能的類肝細(xì)胞。綜上所述，體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成功能完備的類肝細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)，但是骨髓干細(xì)胞體內(nèi)在什么微環(huán)境下，如何橫向分化成類肝細(xì)胞的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3 肝卵圓細(xì)胞與類肝細(xì)胞的聯(lián)系與區(qū)別

1994年國外學(xué)者首次在實(shí)驗(yàn)性肝癌誘發(fā)過程中觀察到一種具有卵圓形核的膽管上皮樣細(xì)胞，F(xiàn)orbes[21]根據(jù)其光鏡下的形態(tài)特點(diǎn)將其命名為“卵圓細(xì)胞”。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在幾乎所有實(shí)驗(yàn)性肝癌的早期均可觀察到卵圓細(xì)胞不同程度的增生，并且在人慢性肝病、肝硬化的標(biāo)本中也存在卵圓細(xì)胞[22]。卵圓細(xì)胞呈現(xiàn)為分化細(xì)胞特點(diǎn)，卵圓細(xì)胞也表達(dá)一系列的表面標(biāo)志物，包括膽管上皮細(xì)胞角蛋白（CK-7，8，18和19）、波形蛋白（vimentin）、OV6、AFP、ALB、GGT、連接子Connexin43、細(xì)胞表面抗原HES6和BPS7，還可以表達(dá)TGF-α、γ-GFB、aFGF、IGF-Ⅱ、SCF及造血祖細(xì)胞的表面標(biāo)志（Thy-1，CD34、c-kit、fit-3）等。由于卵圓細(xì)胞的異質(zhì)性，上述標(biāo)志物在不同的成員表達(dá)也有差異，目前較為公認(rèn)的標(biāo)志物有AFP、ALB、CK19和OV6。這一點(diǎn)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的類肝細(xì)胞具有一定相似性，都具有相同的肝細(xì)胞表面所表達(dá)的標(biāo)志物[23]。

肝卵圓細(xì)胞與類肝細(xì)胞同樣都具有分化功能，卵圓細(xì)胞在特定的微環(huán)境中能活化、增殖和分化，HGF是許多細(xì)胞潛在的絲裂原，Kon等[24]研究HGF作用于OC/CDE22大鼠卵圓細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和其信號傳導(dǎo)通路，將分離的卵圓細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有纖維連接素的培養(yǎng)器皿，加入無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用HGF、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）、血小板生成素（thrombopoietin）進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示HGF通過PI3k/AKT的激活可使卵圓細(xì)胞增殖。LJA和SIP對細(xì)胞的作用主要通過EDG受體介導(dǎo)。

類肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞都具有橫向分化征象，Couri等[25]證實(shí)純化很高的成年大鼠的肝卵圓細(xì)胞，培養(yǎng)在高糖環(huán)境中能橫向分化形成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，對今后糖尿病的治療有很大的意義。類肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞同時都具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生及激活肝干細(xì)胞功能，但類肝細(xì)胞如何激活肝干細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 展望

盡管近年來對間充質(zhì)干細(xì)胞如何分化為類肝細(xì)胞的研究取得了很大的進(jìn)步，但仍然有許多問題尚待解決：到目前為止沒有十分完善的分離、培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，至今還未能篩選到MSCs特異的標(biāo)記分子以及誘導(dǎo)分化成類肝細(xì)胞的成熟方案。具體是什么機(jī)制誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向多向分化？以及誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞和肝干細(xì)胞或卵圓細(xì)胞之間的區(qū)別和聯(lián)系？這些問題都有待于進(jìn)一步研究和探討。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的可獲性、可擴(kuò)增性及向類肝細(xì)胞分化性為我們展示了良好的研究和應(yīng)用前景，類肝細(xì)胞所具有的肝細(xì)胞形態(tài)、表型和肝細(xì)胞的功能及其具有的低免疫原性的特點(diǎn)[26]，在細(xì)胞替代治療、基因治療[27]以及組織器官的再造中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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