脫水對(duì)條斑紫菜葉狀體psbA和psbD基因表達(dá)量的影響

楊 芳,王廣策,張寶玉,陳張帆,潘光華

(1.天津科技大學(xué),天津 300457;2.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071)

潮間帶是指大潮高潮線與大潮低潮線之間的海岸帶,是由海洋向陸地過(guò)渡的中間地帶。該地區(qū)在高潮時(shí)被海水淹沒(méi),具有一定的海洋環(huán)境特性;低潮時(shí)露出,又具有一定的陸地環(huán)境特性,因此潮間帶是研究生物由海洋進(jìn)化到陸地的關(guān)鍵區(qū)域。除了潮水漲落的變化外,潮間帶地區(qū)的鹽度、光照、溫度等其他環(huán)境因子水平的變化幅度也很大。在這種海陸交替的特殊地區(qū)生存著許多具有特殊生活習(xí)性的物種,構(gòu)成了獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。這些生物不僅適應(yīng)了潮漲潮落,對(duì)周期性的脫水和復(fù)水具有很好的耐受力,對(duì)環(huán)境因子水平的大尺度周期性變化也具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。

紫菜是重要的潮間帶大型紅藻。因含有較高含量的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維,紫菜早已成為人類的食物[1];紫菜養(yǎng)殖業(yè)在中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家也已經(jīng)成為大規(guī)模的大型海藻產(chǎn)業(yè)之一。條斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)是紫菜屬中的重要物種,主要生長(zhǎng)在太平洋西北部包括中國(guó)東部沿岸在內(nèi)的大部分地區(qū),日本和韓國(guó)沿岸[2]。研究表明條斑紫菜具有耐干出的特點(diǎn),暴露在空氣中幾天仍然能夠在海水中完全恢復(fù)[3]。利用條斑紫菜的耐干出特點(diǎn),將其在空氣中人工干出已經(jīng)成為條斑紫菜養(yǎng)殖和保種的重要應(yīng)用技術(shù)之一。條斑紫菜的半浮筏式養(yǎng)殖法就是讓附著在養(yǎng)殖網(wǎng)上的紫菜隨潮汐漲落經(jīng)歷脫水(干出)復(fù)水過(guò)程。這種養(yǎng)殖方法很適合在潮汐落差較大的潮間帶[2]。海水養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)驗(yàn)證明,在空氣中適當(dāng)干出藻體可以增強(qiáng)藻體對(duì)病害的抵御能力,去除競(jìng)爭(zhēng)性雜藻,如硅藻,從而提高紫菜的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。此外,傳統(tǒng)的保存條斑紫菜葉狀體的方法是將紫菜放在陰涼處迅速晾干置于-20℃保存,這種保存方法在發(fā)展中國(guó)家仍然很常用。如果將藻體脫水至含水量 20%左右,藻體可以保存將近 12個(gè)月[2]。由此可見,條斑紫菜的養(yǎng)殖和保種都得益于其耐干出特性,這使得研究脫水對(duì)條斑紫菜的影響意義重大。

光合作用受到多種環(huán)境因子的影響,其中影響最大的因素就是水分[4]。因此,很多人研究了潮間帶大型海藻在脫水過(guò)程中的光合活性的變化。研究發(fā)現(xiàn)一些潮間帶大型海藻在適度脫水時(shí)光合速率會(huì)顯著增強(qiáng)[3,5-8];而腹枝藻[9],壇紫菜[10]和半葉紫菜[4]在適度脫水過(guò)程中則沒(méi)有光合速率增大的現(xiàn)象。但是,這些研究多是停留在生理水平上,很少有報(bào)道涉及大型海藻在脫水過(guò)程中的分子水平的變化機(jī)制。條斑紫菜作為光能自養(yǎng)型生物,其光合作用對(duì)水分變化十分敏感,但是其又具有脫水?dāng)?shù)小時(shí)后遇水能快速恢復(fù)的特性,并且這種特性被廣泛應(yīng)用于條斑紫菜的養(yǎng)殖和保種業(yè)中。因此,在分子水平上研究條斑紫菜光合作用的相關(guān)蛋白對(duì)脫水復(fù)水的響應(yīng)機(jī)制具有十分重要的意義。

葉綠體是進(jìn)行光合作用非常重要的細(xì)胞器。條斑紫菜的葉綠體為星狀,很不規(guī)則,從進(jìn)化的角度上說(shuō)屬于很低等的[11]。在條斑紫菜葉綠體內(nèi)的類囊體膜上鑲嵌有光系統(tǒng) I ( PSⅠ) 和光系統(tǒng)Ⅱ( PSⅡ)蛋白復(fù)合體。PSⅡ的反應(yīng)中心是反應(yīng)中心蛋白結(jié)合P680、去鎂葉綠素等電子傳遞體的復(fù)合物,該復(fù)合物將電子由PSⅡ傳遞給PSⅠ,從而完成光合作用重要步驟[12]。PSⅡ的D1 和D2兩個(gè)反應(yīng)中心蛋白分別由葉綠體基因psbA 和psbD編碼。因此,研究藻類的psbA 和psbD基因?qū)ρ芯科涔夂献饔镁哂兄匾饬x。對(duì)于條斑紫菜,陳張帆等人研究了其不同生長(zhǎng)階段——?dú)ゆ咦?、孢子體和葉狀體,psbA 和psbD基因轉(zhuǎn)錄水平的不同,結(jié)果表明不同階段的條斑紫菜psbA 和psbD轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量不同,認(rèn)為殼孢子發(fā)育成葉狀體的過(guò)程需要光合作用提供能量[13]。而有關(guān)條斑紫菜的psbA 和psbD在脫水復(fù)水過(guò)程中表達(dá)量的變化尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選取處于不同脫水和復(fù)水階段的條斑紫菜葉狀體為材料,對(duì)其psbA和psbD轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行研究,以探討組裝 PSⅡ的中心蛋白(D1,D2蛋白)的基因在條斑紫菜處于不同脫水復(fù)水階段時(shí)的變化。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及制備

條斑紫菜葉狀體于 4月份采于青島第一海水浴場(chǎng),用滅菌海水沖洗干凈。吸干藻體表面可見水珠,稱取適量藻體于密閉塑料袋中,-80℃冰箱保存,作為相對(duì)含水量為100%的實(shí)驗(yàn)材料。將剩余藻體進(jìn)行陰干處理,讓其于實(shí)驗(yàn)室條件下自然脫水 15 min、60 min和105 min,分別于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。剩余藻體進(jìn)行復(fù)水30 min處理后于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。

1.2 樣品相對(duì)含水量的測(cè)定及定量PCR分析

1.2.1 條斑紫菜體葉狀體相對(duì)含水量測(cè)定

相對(duì)含水量測(cè)定方法：吸干藻體表面可見水珠,用分析天平稱初始質(zhì)量。與1.1.2同種處理方法對(duì)藻體進(jìn)行脫水處理,每15 min測(cè)定1次藻體質(zhì)量。最后 1次稱質(zhì)量后,將藻體置于 60℃烘箱中,烘干至恒質(zhì)量(約48 h),作為藻體干質(zhì)量,并計(jì)算相對(duì)含水量(3個(gè)平行樣)。

相對(duì)含水率(RWC)計(jì)算公式：

其中,W0為初始質(zhì)量(g),Wt為特定時(shí)間藻體質(zhì)量(g),Wd為藻體干質(zhì)量(60℃,48 h)。

1.2.2 總RNA提取

將100 mg條斑紫菜葉狀體樣品分別于液氮中充分研磨至粉末狀,轉(zhuǎn)移到 1.5 mL離心管中。加入1 mL Trizol(Invitrogen)試劑混勻,室溫放置5 min。13 000g,4℃,離心1 0 min。取上清移至新離心管中。加入200 μL預(yù)冷的氯仿,振蕩15 s,室溫下靜置2～3 min。13000g,4℃,離心15 min。取上清移至新離心管中。加入500 μL預(yù)冷的異丙醇,于-20℃冰箱中靜置 20～30 min。13 000g,4℃,離心 10 min。棄上清,沉淀中加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀。10 000g,4℃,離心5 min。棄上清,于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干 5 min。加入適量的 DEPC水溶解 RNA,于-80℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。

1.2.3 總RNA中微量DNA的去除

提取的總 RNA中加入 RQ1 Rnase-Free Dnase(Promega),37℃,30 min消化DNA。加入4 μL Stop Solution,65℃反應(yīng)10 min,終止消化反應(yīng)。

1.2.4 cDNA合成

根據(jù) M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)的說(shuō)明書,在新的離心管中加入隨機(jī)引物(100μmol/L)2.7 μL,消化好的RNA模板10.65 μL。70℃,變性5 min。轉(zhuǎn)移到冰上冷卻 2 min。在離心管中加入：M-MLV 5?Reaction Buffer 5μL,dNTP mix(10 mmol/L)5 μL,RNase Inhibitor 0.65 μL,M-MLV RT 1μL。36℃,反轉(zhuǎn)錄60 min。稀釋1 000倍作為熒光定量PCR的模板,于-20℃保存待用。

1.2.5 熒光定量PCR

熒光定量PCR所用引物及反應(yīng)條件引用陳張帆的實(shí)驗(yàn)方法[13],引物由上海生工合成。每個(gè)樣品均重復(fù)3管,設(shè)空白對(duì)照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)△△CT法[14]分析數(shù)據(jù)。計(jì)算psbA和psbD的相對(duì)表達(dá)量的差異,采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較以判斷有無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 條斑紫菜葉狀體相對(duì)含水量測(cè)定結(jié)果

在條斑紫菜干出過(guò)程中每隔15 min測(cè)定一次材料的質(zhì)量,計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所用條斑紫菜葉狀體的相對(duì)含水量,并擬合出相對(duì)含水量與材料脫水時(shí)間的關(guān)系曲線。根據(jù)所得數(shù)據(jù)可以確定條斑紫菜在未脫水,脫水15 min、60 min和105 min時(shí)藻體的相對(duì)含水量分別約為100%、71%、34%和21%。

2.2 樣品總RNA的檢測(cè)

獲得的樣品的總 RNA在電泳圖譜(圖1)中出現(xiàn)28S,18S rRNA清晰的電泳帶,1,2,3,4,5所對(duì)應(yīng)的條帶從下到上分別為5S,18S,28S rRNA。本研究使用的總RNA含量較高,純度好且無(wú)降解。

圖1 條斑紫菜總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from Porphyra yezoensis with various relative water content (RWC) of rehydration

2.3 psbA、psbD相對(duì)表達(dá)量的變化

如圖2所示,psbA、psbD基因在脫水過(guò)程中相對(duì)表達(dá)量呈先增大后減小的趨勢(shì),并且psbA基因的相對(duì)表達(dá)量的變化幅度比psbD基因要大。在含水量約為 71%時(shí)兩基因的相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到最大,此時(shí),psbA基因的相對(duì)表達(dá)量是正常狀態(tài)(相對(duì)含水量100%)下該基因的相對(duì)表達(dá)量的 7.18倍(P <0.01);psbD基因的相對(duì)表達(dá)量是正常狀態(tài)下該基因的相對(duì)表達(dá)量的3.13倍(P <0.01);psbA基因的相對(duì)表達(dá)量是psbD基因的相對(duì)表達(dá)量的2.29倍(P <0.05)。進(jìn)一步脫水的過(guò)程中,兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量都降低,當(dāng)含水量達(dá)到21%時(shí)兩基因的相對(duì)表達(dá)量基本持平,且都比正常狀態(tài)下的相對(duì)表達(dá)量低(P <0.01)。復(fù)水后,psbA基因的相對(duì)表達(dá)量是正常狀態(tài)下的0.68倍(P <0.01);psbD基因的相對(duì)表達(dá)量是正常狀態(tài)下的0.30倍(P <0.01);此時(shí),psbA基因的相對(duì)表達(dá)量是psbD基因的相對(duì)表達(dá)量的2.25倍(P <0.01)。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)不同脫水復(fù)水階段的條斑紫菜細(xì)胞中psbA, psbD基因的轉(zhuǎn)錄水平上相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.2 Variations in psbA and psbD transcript levels using real-time PCR.Total RNA was isolated from samples with various relative water content (RWC) of rehydration

3 討論

條斑紫菜葉狀體中具有很高的多糖和蛋白含量,這給提取純度較高質(zhì)量較好的RNA帶來(lái)了困難。本研究通過(guò)Trizol法得到了條斑紫菜葉狀體的總RNA中18S和28S rRNA,其電泳條帶都較清晰且沒(méi)有拖尾降解現(xiàn)象,表明通過(guò)這種方法提取的RNA質(zhì)量較好。熒光定量PCR技術(shù)是一種可以檢測(cè)低豐度基因表達(dá)的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)中使用能非特異性地滲入DNA雙鏈中發(fā)生熒光信號(hào)的SYBR Green染料,因此在實(shí)驗(yàn)中要避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增與引物二聚體。所采用的三對(duì)特異性引物(psbA、psbD和18S rRNA的引物)均使用陳張帆[13]已被證實(shí)的引物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理上采用了相對(duì)定量法,有效降低了各種誤差。

有關(guān)缺水對(duì)高等植物光合作用影響的研究已經(jīng)比較深入。早期有研究表明,PSⅡ?qū)γ撍踔潦禽p微脫水都很敏感,嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生損傷[15]。但也有研究指出,PSⅡ甚至整個(gè)光合作用復(fù)合體可以積極抵御缺水脅迫[16-17]。對(duì)于高等植物在水分脅迫下的psbA、psbD表達(dá)量的變化已有人研究。劉文娟等人對(duì)兩種小麥品種綿農(nóng)4號(hào)和5號(hào)的研究表明水分脅迫下,兩種小麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉(zhuǎn)錄水平下降[18];Yuan Shu等[19]對(duì)大麥的研究結(jié)果也表明水分脅迫下,大麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)下降;He等[20]的研究結(jié)果表明,小麥(Triticum aestivumL.cv.Longchun No.10)的psbA、psbD在缺水情況下表達(dá)量降低是由于轉(zhuǎn)錄水平降低或者mRNA 的穩(wěn)定性降低;Collett等[21]發(fā)現(xiàn)Xerophyta humilis的psbR,ChlP,psbA和psbP基因在該植物脫水過(guò)程中分別呈現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量下降趨勢(shì);Zhang等[22]的研究結(jié)果則表明沙漠植物Ammopiptanthus mongolicus在缺水的情況下的cab基因會(huì)下調(diào),但是psbA基因則沒(méi)有很大變化。對(duì)于高等植物缺水狀態(tài)下的光合作用的分子變化機(jī)制的研究不僅局限于此,但是有關(guān)潮間帶大型海藻對(duì)脫水的研究卻多在生理水平上,幾乎沒(méi)有深入到分子水平的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了條斑紫菜葉狀體不同脫水復(fù)水階段中的psbA 基因(編碼 D1)和psbD基因(編碼D2)在轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量的變化。選用脫水15 min,60 min,105 min(即對(duì)應(yīng)相對(duì)含水量為71%,34%,21%)分別代表輕微脫水、中度脫水和嚴(yán)重脫水 3個(gè)階段。結(jié)果表明在輕微脫水狀態(tài)下,psbA、psbD相對(duì)于18S rRNA (管家基因)的表達(dá)量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)(圖2)。這個(gè)研究結(jié)果與高等植物在脫水過(guò)程中的相應(yīng)研究結(jié)果相差甚遠(yuǎn),但是恰恰與之前本組實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x研究的條斑紫菜在脫水過(guò)程中PSⅡ活性的變化趨勢(shì)相一致：即 PSⅡ活性在藻體輕度脫水狀態(tài)下反而比正常狀態(tài)下的略有升高,并且隨著脫水程度的加劇,其活性逐漸降低至接近于零(未發(fā)表資料)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：由于條斑紫菜在輕度脫水時(shí)僅是藻體細(xì)胞表層水分蒸發(fā),使藻體細(xì)胞能夠更好的接觸到空氣中較多的 CO2,導(dǎo)致藻體本身需要更多的化學(xué)能來(lái)固定碳,因此形成反饋調(diào)節(jié)。為促使光反應(yīng)增強(qiáng),編碼PSⅡ的中心蛋白的psbA、psbD基因會(huì)表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平以滿足其需求,從而導(dǎo)致了PSⅡ的活性出現(xiàn)暫時(shí)增強(qiáng)的現(xiàn)象。由此,作者推斷在輕度脫水狀態(tài)下psbA和psbD基因轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量的快速增大可能是藻體暴露在空氣中時(shí)適應(yīng)陸地環(huán)境的初始響應(yīng)。而隨著脫水程度的加劇,細(xì)胞本身水分揮發(fā),沒(méi)有足夠的水進(jìn)行正常的生命活動(dòng),光合作用的光化學(xué)反應(yīng)也沒(méi)有足夠的水以備裂解。表現(xiàn)為 PSⅡ的活性迅速降低,藻體本身不再需要大量的PSⅡ中心蛋白。因此,psbA、psbD基因會(huì)有較低的轉(zhuǎn)錄水平以減少物質(zhì)消耗而處于光合作用減弱甚至是休眠狀態(tài)。

然而,在測(cè)定PSⅡ的中心蛋白D1、D2的mRNA分子表達(dá)水平的變化時(shí)發(fā)現(xiàn),雖然psbA、psbD的相對(duì)表達(dá)量都呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì),但增大的幅度卻相差很大(圖2)。Kapoor等[23]在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)現(xiàn),雖然psbA和psbD基因的表達(dá)均增大,但是它們的增大倍數(shù)不同。這與本研究的結(jié)果一致,表明雖然D1蛋白和D2蛋白在PSⅡ反應(yīng)中心復(fù)合物中以同比例裝配,但是psbA和psbD基因的mRNA水平上的表達(dá)量變化幅度并不同步。此外,有關(guān)D1蛋白的研究表明,D1蛋白暴露于強(qiáng)光下或處于強(qiáng)光與環(huán)境脅迫相偶聯(lián)的環(huán)境時(shí),其降解速率就會(huì)超過(guò)合成速率[24-25]。類囊體膜發(fā)生損傷時(shí),D1蛋白開始周轉(zhuǎn),同時(shí) PSⅡ伴隨著新合成的 D1蛋白的合成重新組裝。對(duì)藍(lán)藻Synechocystissp.PCC6803的研究表明,對(duì)蛋白合成過(guò)程中的表達(dá)步驟的控制是在高光強(qiáng)下PSⅡ光抑制的主要原因[26],而psbA基因的 mRNA的翻譯是D1蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟[27-28],這使得研究psbA基因 mRNA的表達(dá)量具有更重要意義。條斑紫菜脫水過(guò)程中psbA基因轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量高于psbD基因,可能是由于脫水過(guò)程導(dǎo)致 D1蛋白快速周轉(zhuǎn),因此需要大量的psbA基因的mRNA來(lái)支持D1蛋白的快速周轉(zhuǎn)。同時(shí)說(shuō)明,對(duì)于不同的psbA和psbD基因的mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量而言,二者的有效翻譯率或組裝率必定不同。

另外,有研究表明 Dl蛋白的合成還受 PSⅡ中其他蛋白質(zhì)協(xié)同表達(dá)的影響。在缺失psbD的Chlamydomonas reinhardtii中,盡管 D1蛋白的mRNA含量正常,但由于D2蛋白不能被合成,因此Dl蛋白也不存在[29];反之,在psbA失活的Syneehocystis6803的突變體中,Dl蛋白不能形成,D2蛋白也不積累[30]。即真正組裝的PSⅡ的中心蛋白的量是由相對(duì)含量較少的蛋白決定的。本實(shí)驗(yàn)中,雖然在輕度(RWC 71%)和中度(RWC 34%)脫水狀態(tài)下psbA基因的相對(duì)表達(dá)量是psbD基因的相對(duì)表達(dá)量的2.29倍(P <0.05)和5倍(P <0.01),但psbD基因的相對(duì)表達(dá)量較低,因此認(rèn)為真正組裝的 PSⅡ的中心蛋白的量不是由psbA基因的mRNA決定,而是由psbD基因的 mRNA決定。有關(guān)引起psbA和psbD基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致的原因還有待進(jìn)一步研究。

[1]Noda H.Health benefits and nutritional properties of nori [J].J Appl Phycol,1993,5：255-258.

[2]馬家海,蔡守清.條斑紫菜的栽培與加工 [M].北京：科學(xué)出版社,1996：1-120.

[3]Lipkin Y,Beer S,Eshel A.The ability ofPorphyra linearis(Rhodophyta) to tolerate prolonged periods of desiccation [J].Bot mar,1993,36：517-523.

[4]Lin A P,Wang G C,Yang F,et al.Photosynthetic parameters of sexually different parts ofPorphyra katadaivar.hemiphylla(Bangiales,Rhodophyta) during dehydration and re-hydration [J].Planta,2009, 229：803-810.

[5]Quadir A,Harrison P J,Dewreede R E.The effects of emergence and submergence on the photosynthesis and respiration of marine macrophytes [J].Phycologia,1979,18：83-88.

[6]Johnston A M,Raven J A.The analysis of photosynthesis in air and water ofAscophyllum nodosum(L.) Le Jol.[J].Oecologia,1986,69：288-295.

[7]Madsen T V,Maberly S C.A comparison of air and water as environments for photosynthesis by the intertidal algaFucus spiralis(Phaeophyta) [J].J Phycol,1990,26(1)：24-30.

[8]Sampath-Wiley P,Neefus C D,Jahnke L S.Seasonal effects of sun exposure and emersion on intertidal macroalgae physiology：Fluctuations in antioxidant contents,photosynthetic pigments and photosynthetic efficiency in the red algaPorphyra umbilicalisKützing(Rhodophyta,Bangiales) [J].J Exp Mar Biol Ecol,2008,361(2)：83-91.

[9]Hodgson L M.Photosynthesis of the red algaGastroclonium coulteri(Rhodophyta) in response to changes in temperature,light intensity,and desiccation[J].J Phycol,1981,17(1)：37-42.

[10]Zou D H,Gao K S.Effects of desiccation and CO2concentrations on emersed photosynthesis inPorphyra haitanensis(Bangiales,Rhodophyta),a species farmed in China[J].Eur J Phycol,2002,37：587-592.

[11]李映霞．三種紅藻光合作用色素系統(tǒng)的比較研究[D].青島：中國(guó)科學(xué)院海洋研究所博士論文,2007：1-110.

[12]Buchanan B B.Biochemistry and Molecular Biology of Plants [M].Beijing：Science Press,2000：586-601.

[13]陳張帆,王廣策.條斑紫菜光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白編碼psbA和psbD 的表達(dá)分析 [J].海洋科學(xué),2008,32(7)：52-56.

[14]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J].Methods,2001,25：402-408.

[15]Havaux M,Canani O,Malkin S.Photosynthetic responses to water stress in leaves expressed by photoacoustics and related methods.II.The effect of rapid drought on the electron transport and relative activities of the two photosystems [J].Plant Physiol,1986,82：834-839.

[16]Cornic G.Drought stress inhibits photosynthesis by decreasing stomatal aperture — not by affecting ATP synthesis [J].Trends Plant Sci,2000,5：187-188.

[17]Havaux M.Stress tolerance of photosystem II in vivo：antagonistic effects of water,heat,and photoinhibition stresses [J].Plant Physiol,1992,100：424-432.

[18]劉文娟,袁 澍,張年輝,等.水分脅迫對(duì)不同小麥品種光系統(tǒng)Ⅱ功能基因psbA,psbD及cab表達(dá)的影響 [J].西北植物學(xué)報(bào),2005,25(4)：714-718.

[19]Yuan S,Liu W J,Zhang N H,et al.Effects of water stress on major photosystem II gene expression and protein metabolism in barley leaves [J].Physiol Plantarum,2005,125(4)：464-473.

[20]He J X,Wen J Q,Chong K,et al.Changes in transcript levels of chloroplastpsbA andpsbD genes during water stress in wheat leaves [J].Physiol Plantarum,2002,102(1)：49-54.

[21]Collett H,Butowt R,Smith J,et al.Photosynthetic genes are differentially transcribed during the dehydration-rehydration cycle in the resurrection plant,Xerophyta humilis[J].J Exp Bot,2003,54(392)：2593-2595.

[22]Zhang L X,Li W R,Bi Y R,et al.Water availability affects photosynthetic gene expression in the desert plantAmmopiptanthus mongolicus[J].Israel J Plant Sci,2002,50：243-250.

[23]Kapoor S,Maheshwari S C,Tyagi A K.Developmental and light-dependent cues interact to establish steady-state levels of transcripts for photosynthesis-related genes(psbA,psbD,psaA andrbcL) in rice(Oryza sativaL.) [J].Curr Genet,1994,25：362-366.

[24]Anderson J M,Park Y I,Chow W S.Photoinhibition and photoprotection of photosystem Ⅱ in nature[J]．Physiol Plant,1997,100：2l4-223.

[25]Niyogi K.Photoprotection revisited：genetic and molecular approaches [J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1999,50：333-359.

[26]Yokota A,Takahara K,Akashi K.Water stress.Madhava Rao K V,Raghavendra A S,Janardhan Reddy K (eds.).Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants[M],Springer Netherlands,2006：15-39.

[27]Staub J M,Maliga P.Translation ofpsbA mRNA is regulated by light via the 5’-untranslated region in tobacco plastids [J].Plant J,1994,6(4)：547-553.

[28]Hirose T,Sugiura M.Cis-acting elements and trans-acting factors for accurate translation of chloroplastpsbA mRNAs：development of an in vitro translation system from tobacco chloroplasts [J].EMBO J,1996,15(7)：1687-1695.

[29]Erickson J M,Rahire M,Malno? P,et al.Lack of the D2 protein in aChlamydomonas reinhardtii psbD mutant affects photosystem II stability and D1 expression[J].EMBO J,1986,5(8)：1 745-1 754.

[30]Nilsson F,Andersson B,Jansson C.Photosystem II characteristics of a constructedSynechocysfis6803 mutant lacking synthesis of the D1 polypeptide [J].Plant Mol Biol,1990,14：1 051-1 054.