喉癌中肝細(xì)胞再生磷酸酶-3的表達(dá)及與微血管密度的相關(guān)性*

胡海麗 董雪蕾 田秀芬

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈明顯增加的趨勢,其中95%～98%為鱗狀細(xì)胞癌。喉癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是影響5年生存率的主要原因。新生血管形成在惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起核心作用，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長速度是正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長速度的200～2 000倍。本研究通過檢測喉癌組織和癌旁組織中肝細(xì)胞再生磷酸酶-3（PRL-3）表達(dá)情況及微血管密度（MVD）計數(shù)情況，分析PRL-3與MVD在相關(guān)性及二者在喉鱗狀細(xì)胞癌各病理因素中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2006年1月—2008年12月收治的69例喉鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織標(biāo)本，所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及任何免疫治療。其中高分化鱗癌28例，中分化鱗癌15例，低分化鱗癌26例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例。按國際抗癌協(xié)會（UICC）TNM分類標(biāo)準(zhǔn)（2002）分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期16例。另取25例同批患者的癌旁組織為對照，癌旁組織取自肉眼觀察距腫瘤邊緣1.0 cm以外的喉黏膜組織，均經(jīng)病理證實未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。

1.2 試劑與設(shè)備 PRL-3羊抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），PRL-3二抗PV9003試劑盒、DAB顯色劑、鼠抗人單克隆抗體CD105（北京中杉金橋生物工程有限公司）。圖像采集采用Lecia顯微照像系統(tǒng)（德國）。圖像分析采用Biosens Digital Imaging System v1.6（上海山富科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法及結(jié)果判定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟，采用免疫組化SABC法檢測標(biāo)本PRL-3。免疫組化染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比例綜合評分,染色強(qiáng)度評分：無染色0分，淡黃色顆粒1分，淺棕黃色顆粒2分，深棕黃色顆粒3分。陽性細(xì)胞數(shù)比例評分：每片隨機(jī)觀察5個高倍視野，計數(shù)500個細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。將染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞數(shù)比例評分相加，其和＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。

MVD計數(shù)方法:CD105定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿，陽性者被染成棕黃色，組織MVD計數(shù)按照Weidner等[1]的方法并加以改進(jìn)，先在100倍光鏡下尋找腫瘤中血管密度最高的5個區(qū)域，然后在200倍光鏡下計數(shù)微血管的數(shù)目，5個區(qū)域的均值為該腫瘤的MVD，不論有無管腔，看到單個孤立內(nèi)皮細(xì)胞或多個內(nèi)皮細(xì)胞緊密排列均計數(shù)為1個血管,呈管狀者只要結(jié)構(gòu)不相連續(xù)，分支結(jié)構(gòu)也作為1個血管計算。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計數(shù)，MVD計數(shù)單位為個/高倍視野（個/HP）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，樣本率的比較采用χ2檢驗，計量資料用±s表示，均數(shù)比較采用t驗，PRL-3與MVD相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PRL-3在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)和MVD計數(shù)情況 PRL-3表達(dá)陽性的喉鱗狀細(xì)胞癌組織，在鏡下表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，見圖1、2。25例癌旁組織中陽性表達(dá)2例（8%），69例喉鱗癌組織中陽性表達(dá)45例（65.22%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.031，P＜0.01）。CD105主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，用于標(biāo)記MVD，鏡下見新生血管管腔結(jié)構(gòu)大小不一，形態(tài)不規(guī)則，部分可見管腔結(jié)構(gòu)，部分僅見內(nèi)皮細(xì)胞呈線狀或者點狀分布，見圖3～5。

2.2 PRL-3的表達(dá)和MVD計數(shù)與喉鱗癌的臨床病理特征關(guān)系 低分化患者的PRL-3陽性表達(dá)率高于高、中分化患者，臨床病理分期Ⅲ～Ⅳ期的PRL-3陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PRL-3陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。臨床病理分期Ⅲ～Ⅳ的MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同分化程度患者的MVD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 PRL-3在癌旁組織陰性表達(dá)（SABC法×200）

圖2 PRL-3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)（SABC法×200）

圖3 CD105標(biāo)記的MVD在癌旁組織中（SABC法×200）

圖4 CD105標(biāo)記的MVD在Ⅱ期喉鱗狀細(xì)胞癌組織中（SABC法×200）

圖5 CD105標(biāo)記的MVD在Ⅳ期喉鱗狀細(xì)胞癌組織中（SABC法×200）

表1 喉鱗癌中PRL-3陽性表達(dá)和MVD計數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 PRL-3的表達(dá)與MVD的關(guān)系 PRL-3表達(dá)為+++、++、+及-時的MVD分別為（16.615 4±2.363 0）、（12.187 5±1.978 0）、（10.437 5±1.037 1）及（9.125 0±1.541 1）個/HP。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，PRL-3表達(dá)與MVD呈正相關(guān)（rs=0.811，P＜0.01）。

3 討論

喉癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段、復(fù)雜且連續(xù)的過程，涉及形成血管，進(jìn)入脈管系統(tǒng)并在繼發(fā)的組織器官中生長，最后癌細(xì)胞進(jìn)入淋巴管或血管，形成癌栓并到達(dá)特定的組織器官，最終形成轉(zhuǎn)移灶。PRL-3屬蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP酶）家族中的一員，目前對PRL-3的研究集中在刺激細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)血管形成幾個方面，已在肝癌[2]、結(jié)腸癌[3]、胃癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]、前列腺癌[7]等腫瘤的研究中確認(rèn)，但至今有關(guān)PRL-3在喉鱗癌組織表達(dá)水平的相關(guān)研究報道尚少。本研究表明PRL-3在喉鱗狀細(xì)胞癌中存在過度表達(dá)，主要集中于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，鏡下呈現(xiàn)棕黃色顆粒，且喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PRL-3的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PRL-3陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，臨床病理分期較晚的Ⅲ～Ⅳ期組織PRL-3的陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期的早期患者，提示PRL-3的高表達(dá)與腫瘤的浸潤及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，PRL-3可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物用于監(jiān)控喉癌進(jìn)展。

Guo等[8]通過體外培養(yǎng)表達(dá)PRL-3的細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，證實表達(dá)PRL-3的細(xì)胞可以增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成。CD105又名endog?lin，CD105陽性染色主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),在大血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)[9]。因此本研究選擇CD105對腫瘤的MVD進(jìn)行標(biāo)記。

本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示MVD值越高發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率越大，腫瘤侵襲性越強(qiáng)，MVD可作為反映喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個重要指標(biāo),為抗血管形成治療提供依據(jù)[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PRL-3表達(dá)陽性的評分越高，MVD值越高，血管生成越活躍，PRL-3對血管生成有促進(jìn)作用，MVD的表達(dá)與PRL-3的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PRL-3可能通過血管生成途徑參與喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤及轉(zhuǎn)移。

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