胡占東 公 倩 朱鐵虹 暢繼武
白細(xì)胞介素(IL)-4是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用。新近研究表明,IL-4與哮喘、腎臟疾病和腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[1-2]。但由于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)較復(fù)雜,研究IL-4與上述疾病的內(nèi)在相關(guān)性存在困難。因此尋找一種快速而具有高度特異性的方法是研究IL-4的關(guān)鍵。噬菌體抗體庫(kù)是在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。該技術(shù)不經(jīng)免疫,避免了雜交瘤技術(shù)繁瑣過程,直接通過噬菌體展示人源抗體。本研究運(yùn)用這一技術(shù)構(gòu)建了大容量的人源噬菌體抗體元件庫(kù),并從中篩選得到IL-4-Fab抗體,為進(jìn)一步解決IL-4抗體的表達(dá)與純化,制備新型的檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料 (1)試劑。RNA提取純化試劑TRIzol購(gòu)自Invit-rogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Quantscript RT KIT),DNA聚合酶(2XTaq PCR Master Mix),質(zhì)粒提取試劑盒,DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司;T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、XhoⅠ、SacⅠ和XbaⅠ購(gòu)自TaKaRa公司;胰化蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司,氨芐青霉素(Amp)、四環(huán)素(Tet)、卡那霉素(Kan)、Tween20、PEG8000,Tris堿、牛血清白蛋白(BSA)和IL-4均購(gòu)自Sigma公司。(2)載體、宿主菌與輔助噬菌體。具有抗氨芐青霉素特性的噬菌粒載體pComb3XSS由美國(guó)Scripps研究所CarlosF.Barbas博士贈(zèng)送。大腸桿菌XL1-Blue由本室保存。輔助噬菌體VCSM13含卡那霉素抗性基因,購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。(3)PCR引物。參考美國(guó)Scripps研究所設(shè)計(jì)的一組引物[3],由Invitrogen公司合成。
1.2 方法
1.2.1 重鏈Fd和輕鏈基因的獲得 抽取來自天津市泌尿外科研究所18例健康成人外周血,分離淋巴細(xì)胞。每1×107細(xì)胞加入1 mL TRIzol充分裂解細(xì)胞,提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA。以O(shè)ligo(dT)15為引物,用Quantscript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,分別以重鏈和輕鏈5端和3端引物[3]的不同組合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增重鏈Fd段和輕鏈基因片段。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min。94℃變性1 min,退火溫度因引物的不同組合在52℃~58℃之間變動(dòng)時(shí)間為45 s,72℃延伸1 min。30~32循環(huán)后72℃延長(zhǎng)10 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的DNA,-20℃保存?zhèn)溆?。重?端引物含XhoⅠ酶切位點(diǎn)CTCGAG,3端引物含SpeⅠ位點(diǎn)ACTAGT。輕鏈5端引物含SacⅠ位點(diǎn)GAGCTC,3端引物含XbaⅠ位點(diǎn)TCTAGA。
1.2.2 人源Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 將輕鏈PCR產(chǎn)物混合和載體pComb3XSS分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切,電泳后回收純化DNA。取載體pComb3XSS的酶切片段與輕鏈PCR酶切片段,在連接酶作用下16℃過夜。將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞XL1-blue,進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,搖菌培養(yǎng)構(gòu)建輕鏈庫(kù)[4]。提取輕鏈庫(kù)的質(zhì)粒,經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ酶切鑒定。后將輕鏈庫(kù)噬粒DNA和重鏈Fd段PCR產(chǎn)物分別用XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切,電泳回收目的條帶基因,連接,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,加入3 mL預(yù)熱SOC培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)1 h后取部分稀釋后鋪板,其余加入10 mL預(yù)熱的SB+A+T培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)1 h后加Amp至100 mg/L,振蕩1 h,加入輔助噬菌體VCSM13約1012pfu/mL混勻后并入100 mL SB+A+T培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)2 h后加入Kan至70 mg/L后振蕩培養(yǎng)過夜。次晨離心收集上清后加入PEG沉淀液,冰浴后離心棄上清,1%BSA-PBS溶解沉淀后離心收集上清即為構(gòu)建的人源Fab段抗體庫(kù)。取噬菌體Fab段抗體庫(kù)上清感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XL1-blue菌液,鋪板過夜培養(yǎng),測(cè)定庫(kù)容??贵w庫(kù)酶切鑒定:從平板上隨機(jī)抽取10個(gè)菌株,提取質(zhì)粒,經(jīng)XhoⅠ和SpeⅠ、SacⅠ和XbaⅠ、SacⅠ和SpeⅠ,雙酶切,XhoⅠ單酶切鑒定。
1.2.3 抗IL-4-Fab抗體的篩選 參考文獻(xiàn)[5]方法,以IL-4為抗原包被于96孔板中,次日3%BSA-PBS封閉后加入新鮮制備的抗體庫(kù)上清,濕盒中37℃孵育2 h;棄抗體庫(kù)液,用含0.05%Tween-20的PBS洗去未結(jié)合的噬菌體抗體。用pH為2.2的Gly-HCl緩沖液洗脫后以2 mol/L Tris中和至中性,感染2 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌XL1-blue后37℃孵育1 h。取100 μL梯度稀釋后鋪板測(cè)定滴度,計(jì)算每輪篩選的產(chǎn)出率;余菌進(jìn)行下一輪的富集,共5輪。
1.2.4 噬菌體-酶聯(lián)免疫吸附法(Phage-ELISA)檢測(cè)和陽(yáng)性克隆基因測(cè)序 從第5輪篩選的平板上隨機(jī)抽取30個(gè)單克隆分別制備噬菌體抗體上清。包被IL-4抗原于酶標(biāo)板上,同時(shí)設(shè)空載體pComb3XSS噬菌體、無關(guān)抗原BSA作為陰性對(duì)照。3%BSA-PBS封閉后加入噬菌體抗體上清[6],37℃孵育2 h。PBST沖洗,加入HA-Tag小鼠單抗,37℃孵育1 h后沖洗,加入HRP-山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1 h,洗板后加TMB顯色,酶標(biāo)儀測(cè)A450值,取A450值最高的陽(yáng)性菌株測(cè)序。
2.1 重鏈Fd和輕鏈基因片段的獲得 PCR擴(kuò)增重鏈Fd和輕鏈基因片段,純化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,于680 bp處可見特異性的目的基因片段,見圖1。
2.2 人源Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 輕鏈庫(kù)質(zhì)粒雙酶切,10個(gè)克隆均顯示出680 bp左右的片段,見圖2。構(gòu)建的Fab段抗體庫(kù),計(jì)算菌落測(cè)定庫(kù)容為2.4×108。構(gòu)建的全庫(kù)單克隆經(jīng)提取質(zhì)粒電泳,見圖3。酶切鑒定:(1)SpeⅠ和XhoⅠ酶切重組質(zhì)粒pComb3XSS,鑒定重鏈Fd的插入,經(jīng)電泳可見10個(gè)質(zhì)粒中9個(gè)顯示出680 bp大小片段,見圖4。(2)SacⅠ/ SpeⅠ酶切重組質(zhì)粒pComb3XSS鑒定Fab的插入,見圖5。電泳顯示10個(gè)質(zhì)粒中有8個(gè)含有約1 500 bp左右的基因片段,重組率為80%。
2.3 IL-4噬菌體抗體的初步制備與鑒定 以IL-4為抗原對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行5輪篩淘,篩選下來的噬菌體抗體滴度分別為4.7×104、1.04×105、2.4×105、5.1×106、1.6×107。第5輪比第1輪噬菌體抗體滴度增加340倍,ELISA檢測(cè)篩選抗體的抗原結(jié)合活性,其中有5個(gè)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為16.7%。A450值最高的單克隆質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示輕鏈核苷酸序列與λ鏈序列同源性為94%,重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈同源性為91%。
利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體在疾病的診斷、治療等方面發(fā)揮了重要的作用[7]。但由雜交瘤技術(shù)制備的動(dòng)物源性抗體容易引起排異反應(yīng),且制備過程復(fù)雜,因此限制了其應(yīng)用。制備人源化抗體能解決上述不足。將人抗體基因片段組裝到載體內(nèi),然后展示到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合即為人源噬菌體抗體庫(kù),可從中篩選到人源化的抗體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)因而成為制備人源抗體的一項(xiàng)重要技術(shù)。用此方法對(duì)選定的抗原篩選特異性抗體,時(shí)間短,價(jià)格低廉,并能大量制備人源化抗體。此法克服了人單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞中抗體不穩(wěn)定、容易丟失的不足及人源抗體來源的困難。
抗體庫(kù)的構(gòu)建是獲得特異性人源抗體的先決條件,其制約因素有抗體片段的形式、基因來源、抗體庫(kù)的容量和多樣性等。目前人源抗體庫(kù)主要有2種形式:ScFv和Fab,ScFv是通過化學(xué)鍵把抗體重輕鏈的可變區(qū)連接起來,其特點(diǎn)是表達(dá)產(chǎn)量高,但易形成多聚體[8],在人體內(nèi)易被代謝,而Fab是表達(dá)的重鏈的Fd段和完整的輕鏈通過二硫鍵形成異二聚體,其產(chǎn)量較ScFv低,但在人體內(nèi)較穩(wěn)定。研究表明,F(xiàn)ab段抗體含有完整的輕鏈和重鏈的第一恒定區(qū),具有與抗原結(jié)合的獨(dú)立功能,經(jīng)儲(chǔ)存1年后,活性無明顯變化[9],F(xiàn)ab段抗體易轉(zhuǎn)化成結(jié)合抗原的功能分子。基于上述因素,本實(shí)驗(yàn)利用噬菌體抗體展示技術(shù)構(gòu)建了人源Fab段噬菌體抗體庫(kù),為今后篩選更優(yōu)質(zhì)抗體的工作奠定了基礎(chǔ)。抗體基因的來源,庫(kù)容與多樣性同樣影響抗體庫(kù)的質(zhì)量。本研究從18例健康成人的外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)40多對(duì)引物擴(kuò)增出Fab抗體基因片段,采用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化,構(gòu)建出庫(kù)容約2.4×108的人源Fab段抗體庫(kù),陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定重組率為80%,表明庫(kù)構(gòu)建良好。
大腸桿菌中能否成功表達(dá)Fab段基因,載體的選擇與設(shè)計(jì)是關(guān)鍵[10]。本實(shí)驗(yàn)選擇噬菌粒pComb3XSS作為載體構(gòu)建抗體元件庫(kù)。在pComb3的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),其優(yōu)點(diǎn)在于增加了載體的穩(wěn)定性;帶有6×His及HA-Tag,為以后的抗體純化與檢測(cè)搭起橋梁;引入琥珀酸終止密碼子,可終止pⅢ融合蛋白的表達(dá),為抗體表達(dá)做準(zhǔn)備。
實(shí)驗(yàn)中,筆者采用固相化抗原吸附法,將IL-4以遞減的稀釋濃度包被于96孔板上,選擇適當(dāng)強(qiáng)度,在保證克隆穩(wěn)定的前提下,對(duì)構(gòu)建的抗體庫(kù)進(jìn)行5輪篩選,可以看到特異性Fab段抗體的得到約340倍的富集。Phage-ELISA檢測(cè)顯示篩選到的噬菌體抗體具有一定的IL-4結(jié)合活性和特異性,陽(yáng)性克隆在提取質(zhì)粒后進(jìn)行DNA測(cè)序,用NCBI中的Nu?cleotide Blast軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示抗體重鏈屬IgG亞類,輕鏈為λ鏈,序列同源性均在90%以上。這表明該方法篩選成功率高,且操作簡(jiǎn)便易行,為體外大規(guī)模生產(chǎn)人源抗體和檢測(cè)血中IL-4水平,提供簡(jiǎn)便價(jià)廉有效的方法。利用該技術(shù)有望篩選出優(yōu)質(zhì)的人源性IL-4-Fab抗體,運(yùn)用于臨床診治中。
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