降解未處理纖維素厭氧混合菌群的篩選及功能

于艷玲，馮玉杰，高 霏，于麗新，徐 琛

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱，yujief@hit.edu.cn)

包括木材及其加工廢棄物、快速生長(zhǎng)的各種草類(lèi)、農(nóng)作物秸稈及城市垃圾等在內(nèi)的纖維素類(lèi)物質(zhì)是世界上最廣泛和廉價(jià)的可再生資源［1-3］.科學(xué)、合理地開(kāi)發(fā)利用這一資源，將是實(shí)現(xiàn)可續(xù)發(fā)展的最有潛力的途徑之一.將纖維素降解為小分子物質(zhì)——糖類(lèi)或糖代謝中間產(chǎn)物［4］，從而利用糖轉(zhuǎn)化平臺(tái)，使纖維素資源化，如產(chǎn)乙醇［5-6］、產(chǎn)電［7-9］、產(chǎn)氫［10］等，是木質(zhì)纖維素獲得應(yīng)用的重要途徑.但由于木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，纖維素尤其是不經(jīng)預(yù)處理的纖維素物質(zhì)很難被微生物降解或降解周期很長(zhǎng).因此，獲得高效穩(wěn)定的原木質(zhì)纖維素降解微生物，是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn).動(dòng)物的瘤胃是自然界最高效的發(fā)酵罐，瘤胃微生物能在48 h內(nèi)消化瘤胃內(nèi)50%的纖維素［11］.因此，瘤胃是很好的纖維素降解菌的菌源庫(kù).模擬瘤胃條件，馴化瘤胃微生物體外降解纖維素，對(duì)于獲得效果好的纖維素降解菌或菌群和研究厭氧纖維素降解菌群內(nèi)的生態(tài)作用有著重要意義.

1 試驗(yàn)

1.1 樣品來(lái)源

取哈爾濱郊區(qū)以秸稈為主要飼料的成年牛的牛胃殘?jiān)?

1.2 培養(yǎng)條件

篩選培養(yǎng)基:750 mL無(wú)機(jī)鹽溶液，250 mL瘤胃液，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g;刃天青(0.1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))1 mL，煮沸并充氮?dú)庀鹾?，每個(gè)培養(yǎng)瓶分裝90 mL，秸稈1 g，每瓶有兩條1 cm×3 cm的新華濾紙作降解指示物，用作失重率實(shí)驗(yàn)時(shí)，不加濾紙條，培養(yǎng)基121℃，濕熱滅菌20 min.其中，無(wú)機(jī)鹽溶液的成分(750 mL):KH2PO4·2H2O 0.5 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO40.5 g，CaC12· 2H2O 0.1 g，MgS04·7H2O 0.1 g，K2HPO4· 3H2O 0.5 g.

瘤胃液的制取:牛瘤胃液4層紗布過(guò)濾.

秸稈:自然風(fēng)干當(dāng)年收成的玉米秸稈，粉碎至2～3 mm.

預(yù)處理的秸稈:預(yù)處理的方法見(jiàn)文獻(xiàn)［12］.

1.3 纖維素厭氧降解菌混合菌群的篩選和馴化

取哈爾濱郊區(qū)以秸稈為主要飼料的成年牛的瘤胃液與瘤胃殘?jiān)鼞覞嵋?0 mL接種到90 mL的篩選培養(yǎng)基中，38.5℃恒溫靜止培養(yǎng).待培養(yǎng)基中的指示濾紙崩解時(shí)，轉(zhuǎn)接于同樣的新鮮培養(yǎng)液中，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，挑選降解速度快且性能穩(wěn)定的樣品，直至篩選出高效穩(wěn)定的混合菌群.

1.4 混合菌群纖維素分解特性測(cè)定

1.4.1 底物失重率的測(cè)定

將1.0 g纖維素類(lèi)物質(zhì)作為唯一碳源制作90 mL培養(yǎng)基，接種10 mL菌液，38.5℃靜止培養(yǎng)5 d后，5 000 r/min離心，倒出清液，用鹽酸和硝酸的混合液沖洗而消除菌體，離心，清水洗，離心，105℃烘干后稱(chēng)重，計(jì)算失重量和失重率［13］.

1.4.2 纖維素酶酶活測(cè)定方法

取0.5 mL酶液，加pH=4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液1.0 mL，加卷曲的新華1號(hào)濾紙(1 cm× 6 cm)一條，于 50℃水浴反應(yīng) 30 min，加入1.0 mL的DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻后加入蒸餾水定容至10 mL，在530 nm下測(cè)定其吸光度.同時(shí)在相同條件下做空白樣調(diào)零.

酶活力單位的定義為:在pH=4.8、50℃條件下，1 mL酶液每分鐘水解濾紙生成1 μg葡萄糖的酶量，稱(chēng)為一個(gè)酶活力單位(IU).

1.4.3 混合菌群中菌種的分離純化

將1.2中所述的培養(yǎng)基中的秸稈和濾紙，換成羧甲基纖維素鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，再加入2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂，厭氧操作制成平板，將富集得到的纖維素厭氧降解菌液采用平板劃線分離法獲得一系列單個(gè)菌落，再挑取單菌落重復(fù)以上操作，直至獲得純培養(yǎng).可作片在顯微鏡下觀察，直至菌株形態(tài)相同，編號(hào)做好記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素厭氧降解菌混合菌群的篩選與馴化

用1.3所介紹的篩選與馴化方法，得到了高效穩(wěn)定的纖維素厭氧降解混合菌群，命名為FYG -2.FYG-2混合菌群在篩選培養(yǎng)的第2天，降解指示物濾紙條出現(xiàn)透明的蝕斑，5 d后濾紙完全崩解，秸稈底物變成乳濁狀，溶液渾濁;以濾紙為唯一碳源時(shí)，溶液顏色變淺(圖1).在培養(yǎng)過(guò)程中，有大量氣體生成，說(shuō)明FYG-2混合菌群中不僅存在纖維素降解菌，還存在產(chǎn)甲烷菌等其他瘤胃菌種［14］.培養(yǎng)3 d，F(xiàn)YG-2混合菌群對(duì)于滅菌和未滅菌濾紙的分解率分別是45.6%和44.8%，誤差小于5%，可以認(rèn)為FYG-2對(duì)滅菌和未滅菌濾紙的降解性能是相同的.

圖1 FYG－2混合菌群培養(yǎng)物

經(jīng)過(guò)30代以上的傳代培養(yǎng)，F(xiàn)YG-2混合菌群對(duì)濾紙分解3 d后，濾紙的失重率基本保持穩(wěn)定(如圖2所示)，說(shuō)明該混合菌群對(duì)纖維素的降解性能穩(wěn)定.FYG-2是一個(gè)混菌體系，利用瘤胃中自然存在的微生物之間的協(xié)同作用降解纖維素，這樣的體系環(huán)境適應(yīng)性和抗干擾能力都要優(yōu)于純菌，多次傳代以后一般不會(huì)出現(xiàn)純菌中存在的退化現(xiàn)象.

圖2 FYG－2的底物失重率與傳代次數(shù)的關(guān)系

2.2 FYG－2混合菌群的纖維素分解特性

2.2.1 對(duì)不同纖維素類(lèi)物質(zhì)的分解

分別以預(yù)處理的秸稈、未處理的秸稈和濾紙為底物，考查了FYG-2混合菌群對(duì)不同類(lèi)型纖維素的分解情況(表1).表1結(jié)果表明，38.5℃靜止培養(yǎng)3 d后，預(yù)處理秸稈的底物失重率最低，僅為12.4%，而未處理的秸稈失重率卻達(dá)到了36.5%，濾紙條的失重率最高，為45.6%，說(shuō)明底物降解的難易順序?yàn)闉V紙＞未處理的秸稈＞預(yù)處理后的秸稈.濾紙比秸稈易降解與底物的成分組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，濾紙是純纖維素，暴露的表面積大，則纖維素的吸附可及度就大，所以濾紙降解得快，而天然秸稈中的纖維素包埋在木質(zhì)素和半纖維素中，纖維素降解菌很難吸附到纖維素的表面，致使纖維素降解的難度有所增加.秸稈經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后，纖維素與木質(zhì)素產(chǎn)生了剝離，氫鍵也被打開(kāi)，纖維素充分暴露出來(lái)，但是其失重率卻降低了，這可能有兩方面的原因:一方面可能是秸稈預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸、糠醛、小分子酚類(lèi)等副產(chǎn)物對(duì)混合菌群中的某些菌種有毒性作用［15］，破壞了菌群微生物之間的協(xié)同作用;另一方面，自然界中瘤胃微生物降解的都是未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的自然形態(tài)的纖維素，所以，其協(xié)同作用的機(jī)制在降解自然形態(tài)的木質(zhì)纖維素時(shí)能得到更充分的發(fā)揮.

表1 FYG－2混合菌群降解不同纖維素類(lèi)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)

2.2.2 FYG-2混合菌群的酶活與產(chǎn)酶時(shí)間的關(guān)系

在接菌量為10%，F(xiàn)YG-2混合菌群纖維素酶活隨時(shí)間的變化如圖3所示，在培養(yǎng)的前3天酶活一直處于上升趨勢(shì)，在第3天時(shí)達(dá)到最高為126 IU，而在濾紙已經(jīng)完全崩解的第5天，纖維素酶活卻已經(jīng)降到111 IU，此時(shí)發(fā)酵液的含糖量卻最高達(dá)到了50 mg/L.從圖3還可以看出，第3天和第4天的酶活保持相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)混合菌群中纖維素降解菌是優(yōu)勢(shì)菌群.所以，做為種子液時(shí)，以第3、4天的培養(yǎng)物為宜，而將纖維素的分解產(chǎn)物作為其他用途的底物時(shí)，以第5天的培養(yǎng)物為宜.

圖3 FYG－2酶活與產(chǎn)酶時(shí)間的關(guān)系

2.2.3 FYG-2混合菌群纖維素酶活與初始接菌比例之間的關(guān)系

在不同初始接菌量時(shí)，培養(yǎng)3 d，F(xiàn)YG-2混合菌群的酶活和溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度變化如圖4所示.可以看出，F(xiàn)YG-2的酶活和糖化率不與初始接菌量成正比.在初始接菌量為15%時(shí)，F(xiàn)YG-2的酶活最高，而當(dāng)初始接菌量增加到50%時(shí)，其酶活降低了一半，但是反應(yīng)體系中的葡萄糖質(zhì)量濃度卻提高了一倍多.

纖維素酶是一種反饋抑制酶，其酶活受到產(chǎn)物的反饋抑制.當(dāng)初始接菌量從10%提高到15%，培養(yǎng)液中的含糖量和酶活都在上升，說(shuō)明接種量增加，產(chǎn)酶量也在增加，而酶解產(chǎn)生的糖質(zhì)量濃度也不足以產(chǎn)生反饋抑制.但是當(dāng)初始接種量增加到20%，酶量增加，但是酶解產(chǎn)生的糖質(zhì)量濃度也在增加，此時(shí)的糖質(zhì)量濃度已經(jīng)可以對(duì)纖維素酶產(chǎn)生很大的反饋抑制作用，所以酶活降低.而接種量在20%～40%是一個(gè)產(chǎn)糖和反饋抑制的平衡階段，酶活和產(chǎn)糖量都不會(huì)有太大變化.但是當(dāng)初始接種量足夠大(達(dá)到50%)，糖化速度會(huì)比較快，糖質(zhì)量濃度會(huì)在短時(shí)間內(nèi)快速增加，同時(shí)反饋?zhàn)饔靡矔?huì)使酶活迅速降低.因此，可以依據(jù)不同的目的，選擇初始接種量.

圖4 FYG－2酶活與初始接菌比例之間的關(guān)系

2.2.4 混合菌群微生物間的協(xié)同作用

采用厭氧平板劃線分離的方法，從FYG-2中分離到7株純菌，分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7.將這7株菌和FYG-2分別單獨(dú)接入以纖維素為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基.接入純菌的樣品，纖維素底物未見(jiàn)明顯降解.培養(yǎng)3 d后，分別測(cè)定各個(gè)菌株和FYG-2的酶活，結(jié)果如圖5所示.可以看出，各個(gè)單菌的纖維素酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于混合菌群.這表明FYG-2中微生物間存在強(qiáng)烈的協(xié)同作用.這種協(xié)同作用可能包括纖維素降解菌之間［16］、纖維素降解菌與非纖維素降解菌之間［17］和可培養(yǎng)微生物與不可培養(yǎng)微生物間的協(xié)同作用［18］.

圖5 FYG－2中純培養(yǎng)微生物與混菌酶活的對(duì)比

限于目前的微生物分離技術(shù)的局限性，自然環(huán)境中可分離培養(yǎng)的微生物種類(lèi)只占該環(huán)境下微生物種類(lèi)總數(shù)的0.1% ～10%［19］，不能檢測(cè)那些尚未能培養(yǎng)的微生物，不能很好地反映自然環(huán)境中微生物多樣性的原始狀態(tài).即便對(duì)于可分離培養(yǎng)的微生物，雖然經(jīng)過(guò)多次分離純化，獲得的菌株也存在偶然性.本研究采用以纖維素為唯一碳源的限制性分離方法，獲得的菌株均為纖維素降解菌，無(wú)法獲得非纖維素降解菌和不可培養(yǎng)菌.從現(xiàn)有獲得的7株純菌無(wú)論單獨(dú)還是混合都未得到好的纖維素降解結(jié)果來(lái)看，混合菌群中的協(xié)同作用很可能存在于纖維素降解菌與非纖維素降解菌之間或存在于可培養(yǎng)微生物與不可培養(yǎng)微生物間，因此，很難通過(guò)人工分離再?gòu)?fù)配的方式獲得該菌群的功能.關(guān)于此混合菌群協(xié)同作用的進(jìn)一步研究，將另作報(bào)道.

2.3 FYG－2混合菌群與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的混合菌群的比較

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從不同的篩選源中，采用不同的限制培養(yǎng)方法，構(gòu)建和篩選出一些具有不同功能的纖維素降解混合菌群，選出幾個(gè)效果比較好的菌群MC［18］、MC1［20］、WSC-6［21］、PCS-S［22］和本研究篩選出的FYG-2進(jìn)行了比較(表2).在5個(gè)纖維素降解混合菌群中，F(xiàn)YG-2的纖維素酶活最高，水解液中的還原糖質(zhì)量濃度也最高，這可能與厭氧微生物對(duì)糖的代謝速度慢有關(guān).除了MC，F(xiàn)YG-2的濾紙失重量與其他幾個(gè)菌群不相上下，表明FYG-2對(duì)纖維素的降解速度與其他菌群相當(dāng).但是FYG-2分解纖維素時(shí)的作用溫度卻是最低的，這有利于FYG-2與其他利用纖維素的分解產(chǎn)物產(chǎn)電、產(chǎn)乙醇等微生物的復(fù)配，是FYG-2不可比擬的優(yōu)勢(shì).

表2 各纖維素降解混合菌群的比較

3 結(jié)論

1)獲得了高效穩(wěn)定的纖維素厭氧降解混合菌群，命名為FYG-2.該菌群可以在5 d內(nèi)使1 g的濾紙完全崩解.經(jīng)過(guò)30代以上的傳代培養(yǎng)，其降解性能仍保持穩(wěn)定.且纖維素底物的滅菌與否不影響失重率.

2)FYG-2對(duì)不同類(lèi)型的纖維素底物降解的難易順序?yàn)闉V紙＞未處理的秸稈＞預(yù)處理后的秸稈，混合菌群更適合于降解天然木質(zhì)纖維素.

3)FYG-2混合菌群具有高效且性能穩(wěn)定的酶活.培養(yǎng)第3天纖維素酶活最高，初始接種量為15%可以獲得最高纖維素酶活.

4)FYG-2中微生物間存在強(qiáng)烈的協(xié)同作用，這種協(xié)同作用很可能存在于纖維素降解菌與非纖維素降解菌之間或存在于可培養(yǎng)微生物與不可培養(yǎng)微生物間.

5)FYG-2對(duì)纖維素的分解速度與其他文獻(xiàn)報(bào)道的混合菌群相當(dāng)，但是作用溫度較低，有利于和其他微生物復(fù)配進(jìn)行纖維素資源化的研究.

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