銀翹散體外雞胚成纖維細胞最大安全質(zhì)量濃度

韓 雪，李文蘭，丁振鐸

(1.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;2.哈爾濱商業(yè)大學生命科學

與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱150076;3.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學院，哈爾濱150025)

銀翹散出于清·吳塘《溫病條辨》.臨床上主要用于治療上焦溫病，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥穗、淡豆豉、竹葉、牛蒡子、桔梗、生甘草組成.具有疏散風熱，清熱解毒的功效.陳巧謀等文獻統(tǒng)計銀翹散在治療上呼吸道感染、肺炎、扁桃腺炎與腮腺炎、流行性出血熱療效顯著，總有效率明顯優(yōu)于單純使用西藥［1］.方中君藥金銀花甘寒，清熱解毒;連翹苦，微寒，清熱解毒，消癰散結(jié);臣藥牛蒡子苦寒，疏散風熱，解毒透疹，利咽消腫.大量臨床及藥理研究表明了本方具有抗菌抗病毒、抗炎與抗過敏、解熱鎮(zhèn)痛的的作用［2－4］.中藥多為天然藥物，藥性溫和，不良反應少，是開發(fā)治療病毒性中藥制劑成為可能［5］.

為了進一步研究銀翹散的藥用價值，首先需要弄清它的毒性大小，只有在安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)再進行下一步試驗，才能保證臨床用藥安全、試驗結(jié)果可靠等［6－7］.因此，本試驗選用CEF細胞，采用最常用的形態(tài)學觀察和MTT兩種方法，研究銀翹散在體外CEF中的最大安全質(zhì)量濃度，并試圖找出體外培養(yǎng)條件下銀翹散的細胞毒性與細胞不同培養(yǎng)狀態(tài)(單層與貼壁)之間的關(guān)系.為保證銀翹散在臨床上的安全劑量，避免不良反應的發(fā)生，提供了科學有效依據(jù).為銀翹散開發(fā)成抗病毒藥、抗腫瘤藥及免疫增強劑等提供科學的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

11日齡SPF雞胚，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供.銀翹散(YinQiao Powder)由哈爾濱醫(yī)藥股份有限公司中藥二廠提供.

1.1.1 實驗藥品與生化試劑

胎牛血清(FCS)(Hyclone公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT);二甲基亞砜(DMSO);Hank’原液配方:氯化鉀(KCl)4.0 g，氯化鈉(NaCl)80.0 g，硫酸鎂(MgSo4·7H2O)2.0 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.6 g，磷酸氫二鈉(Na2H PO4·12H2O)1.21g，葡萄糖10.0 g，酚紅0.2 g，無水氯化鈣(CaCl2)1.4 g，氯仿1.0mL，加重蒸水1 000 mL，4℃保存.乳漢液配方:0.5%水解乳蛋白Hank’原液，Hank’10＞母液1 000 mL，乳蛋白水解物50 g，無離子水加至10 000 mL，振蕩溶解后分裝121℃，35 min滅菌.

1.1.2 實驗儀器

MCO175型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);JJT－900/1300超凈工作臺(蘇凈集團);IX70倒置顯微鏡(Olympus公司);Adventurer萬分之一電子天平(Ohaus公司);LD4－2A型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);GILSON移液器(France公司).96孔細胞培養(yǎng)板均購自廣州展晨生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細胞懸液的制備

選擇9～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位，無菌取出雞胚，棄頭，四肢和內(nèi)臟，放入滅菌的玻璃器皿中.用乳漢液洗滌胚體3次，用滅菌的剪刀剪成米粒大的小組織塊，再用乳漢液洗滌2次，然后加入0.25%的Hank’胰酶溶液，在水浴中消化30 min，棄胰酶溶液，用乳漢液洗滌2～3次，再加入適量的營養(yǎng)液(用含10%犢牛血清乳漢液，加抗生素適量)用8層紗布過濾，制成每毫升含活細胞數(shù)約1×106～1.5×106個的細胞懸液，分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 中藥影響CEF貼壁試驗

在96孔細胞培養(yǎng)板的各試驗孔中加入5× 108個/mL的CEF100 μL，取各稀釋度藥物分別加入96孔細胞板，每個質(zhì)量濃度重復4孔，對照孔每孔加CEF和細胞維持液各100 μL，將細胞板用膠帶密封，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).分別于24、48、72 h后觀察，記錄細胞生長情況，判定藥物對細胞貼壁的影響.

1.2.3 中藥影響CEF單層試驗

在96孔細胞培養(yǎng)板的各試驗孔中加入5× 108個/mL的CEF200 μL細胞懸液，用透明膠帶密封.5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞均勻鋪滿單層后取出，吸出生長液，用Hanks液洗一遍，然后棄掉Hanks液，試驗各孔分別加入各質(zhì)量濃度藥物100 μL和細胞維持液100 μL，各質(zhì)量濃度重復4孔，對照孔不加藥物，每孔只加200 μL細胞維持液，用透明膠帶密封，分別于24、48、72 h后觀察，記錄細胞單層的完好程度.

1.2.4 MTT法

取對數(shù)生長期細胞，以5×108個/mLCEF的細胞密度，100 μL/孔，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h細胞均勻鋪滿單層后，棄掉培養(yǎng)液.試驗各孔分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物100 μL/孔和細胞維持液100 μL/孔，各重復4孔;正常細胞對照孔不加藥物只加細胞維持液100 μL/孔;另設(shè)無細胞孔為測定時的空白調(diào)零孔.逐日觀察藥物對細胞貼壁及生長的影響.培養(yǎng)24 h，加入MTT 200 μL/孔，置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，取出96孔細胞培養(yǎng)板加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min后，酶標儀測定OD值.

2 試驗結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度的藥物對CEF貼壁的影響

由表1可知，24 h培養(yǎng)下銀翹散不影響CEF貼壁，最高質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL，對細胞貼壁、生長沒有影響，高于62.5 mg/mL的銀翹散各質(zhì)量濃度具有明顯的細胞毒性，表現(xiàn)為胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質(zhì)，細胞之間空隙加大，細胞變得不規(guī)則，甚至出現(xiàn)部分細胞死亡、崩解、漂浮.

表1 24 h藥物對細胞貼壁的影響

由表2可知，48 h培養(yǎng)下銀翹散不影響CEF貼壁，最高質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL，對細胞貼壁、生長沒有影響，高于62.5 mg/mL的銀翹散各質(zhì)量濃度對細胞有明顯的毒性，細胞輪廓不明顯，核小著色深，核仁不明顯，細胞質(zhì)少.

由表3可知，72 h培養(yǎng)下銀翹散不影響CEF貼壁，最高質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL，對細胞貼壁、生長沒有影響，高于62.5 mg/mL的銀翹散各質(zhì)量濃度具有明顯的細胞毒性，但細胞毒性很小.細胞輪廓明顯，核仁大而明顯，細胞質(zhì)弱嗜堿性.

表2 48 h藥物對細胞貼壁的影響

表3 72 h藥物對細胞貼壁的影響

2.2 不同質(zhì)量濃度的藥物對CEF單層的影響

從表4可以看出來加入藥物24 h后的銀翹散基本不影響CEF單層，24、48、72 h結(jié)果基本一致，而且和貼壁的試驗結(jié)果也較為一致，不影響CEF單層的最大安全質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL.

表4 24 h不同質(zhì)量濃度的銀翹散對CEF單層的影響

從表5可以看出來加入藥物48 h后的銀翹散基本不影響CEF單層，24、48、72 h結(jié)果基本一致，而且和貼壁的試驗結(jié)果也較為一致，不影響CEF單層的最大安全質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL.

表5 48 h不同質(zhì)量濃度的銀翹散對CEF單層的影響

從表6可以看出來加入藥物72后的銀翹散基本不影響CEF單層，24、48、72 h結(jié)果基本一致，而且和貼壁的試驗結(jié)果也較為一致，不影響CEF單層的最大安全質(zhì)量濃度是62.5 mg/mL.

表6 72 h不同質(zhì)量濃度的銀翹散對CEF單層的影響

2.3 MTT法

用統(tǒng)計學軟件SPSS數(shù)據(jù)以ˉx±SD對所測A570值進行檢驗，最后取4個平行孔的平均值，計算細胞破壞百分率%，破壞率%=［A570細胞組－A570給藥組］/A570細胞組.

由表7可知銀翹散對CEF的最大安全質(zhì)量濃度是15.625 mg/mL.當?shù)陀?5.625 mg/mL的質(zhì)量濃度與對照差異不顯著(P＞0.05).說明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)藥物對CEF沒有明顯的細胞毒性，且隨著藥物質(zhì)量濃度的增加.吸光度值增加，活細胞率提高，提示在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)藥物對細胞沒有毒性作用，具有一定的促進細胞生長的作用.但高于15.625 mg/mL的質(zhì)量濃度藥液的吸光度值顯著高于細胞對照組(P＜0.05)，且隨著質(zhì)量濃度的增加，吸光度值逐漸升高，活細胞減少.提示在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)藥物對細胞具有不同程度的毒性作用，隨著質(zhì)量濃度的增大毒性顯著增強.

表7 銀翹散對CEF細胞上最大安全質(zhì)量濃度的測定結(jié)果

3 討論

在本試驗中用形態(tài)學觀察法得出銀翹散對CEF最大安全質(zhì)量濃度62.5 mg/mL，而MTT法得出銀翹散對 CEF的最大安全質(zhì)量濃度是15.625 mg/mL，后一種方法比前一種方法低一個稀釋度.說明MTT法除了比形態(tài)學觀察法更客觀、能定量外，還具有更高的敏感性.藥物細胞安全質(zhì)量濃度測定一般采用形態(tài)觀察法和MTT法［9］.形態(tài)觀察法簡單易行，但結(jié)果定比較繁瑣，劃分等級粗糙，在判斷細胞病變程度時不可避免的存在著主觀因素，客觀性較差.而MTT法是目前廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、細胞毒性試驗以及大規(guī)模抗腫瘤藥物篩選測定的一種常用方法.用該法優(yōu)點是靈敏度高、重復性好、操作簡便、經(jīng)濟、快速、無放射性污染［10］.本試驗選取這兩種方法，以MTT法測定光密度值來補充觀察細胞病變的不足，無疑增強了客觀性及準確性.

研究表明，雞成纖維細胞的增殖主要與成纖維細胞生長因子(FGF)有關(guān)，而(FGF)主要是通過受體－信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)并通過基因表達來實現(xiàn)對成纖維細胞增殖的調(diào)控［9］.本試驗中低于15.625 mg/mL的銀翹散各質(zhì)量濃度都表現(xiàn)出刺激CEF貼壁、生長和增殖的作用.這種促CEF增殖作是否與FGF及其受體有關(guān)，需要進一步研究.而高于15.625 mg/mL的銀翹散各質(zhì)量濃度均有不同程度地表現(xiàn)出對細胞的毒性作用，使完整的雞成纖維細胞單層遭到破壞，細胞崩解、漂浮、死亡.

因此，天然藥物對組織細胞是有毒性的，本試驗通過體外組織細胞培養(yǎng)方法證實了這一點.這為銀翹散的后續(xù)研究中，質(zhì)量濃度的選擇提供了十分重要的依據(jù).最后所測得的光密度值與細胞存活率及活性成正相關(guān)［11］.

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