萊菔硫烷對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞ERK信號(hào)通路的影響

鄒 翔，曲中原，白 晶，季宇彬，

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)中藥學(xué)博士后流動(dòng)站，哈爾濱150076)

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的防癌抗癌效果最好的天然活性成分之一［1－2］，廣泛存在于十字花科植物中，在綠花椰菜中含量最高［3－5］.研究表明，SFN可通過(guò)阻斷化學(xué)物誘發(fā)腫瘤的起始階段，能完全抑制I相酶，并且誘導(dǎo)II相解毒酶的表達(dá)而有效預(yù)防多種癌癥的發(fā)生［6－7］.以往研究表明，SFN可通過(guò)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯及凋亡顯著抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖［8－9］，本文通過(guò)研究SFN對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞中ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響，探討ERK1/2 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在SFN誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡中的作用.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人肝癌HepG-2細(xì)胞株，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.

1.2 藥品和試劑

萊菔硫烷(分子式C6H11NOS2，相對(duì)分子質(zhì)量為177.3，純度98.3%)，美國(guó)Alexis公司，用前以二甲基亞砜(DMSO)溶解，－20℃保存，臨用時(shí)加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，使DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.1%;阿霉素(批號(hào)080907)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基干粉，美國(guó)GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)，美國(guó)Sigma公司;鼠抗P44/42 MAPK抗體、鼠抗p-P44/ 42MAPK抗體、堿磷酶標(biāo)記馬抗鼠IgG，碧云天公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman-Coulter公司;水平電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)Bio-Rad公司;超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán).

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG-2常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，相對(duì)濕度95%)培養(yǎng).2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.5 Western Blotting方法檢測(cè)SFN對(duì)HepG-2細(xì)胞內(nèi)ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后，傳代培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h貼壁后給藥.各給藥組設(shè)計(jì)為:給藥組(SFN終濃度10、20、40 μmol/L)、空白對(duì)照組(加等體積RPMI 1640)、陽(yáng)性對(duì)照組(ADM終濃度0.5 μmol/L).48 h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2～3次、離心，加入裂解液冰上裂解1.5 h，4℃、12 000 r/min離心10 min提取總蛋白.570 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算蛋白含量，并用細(xì)胞裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度.配制5%的濃縮膠及12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳.電泳條件:濃縮膠80 V，待樣品前沿進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓至100 V.轉(zhuǎn)膜條件:200 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min.將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗過(guò)夜.次日，取出NC膜用TBST緩沖液充分振搖洗膜3次，每次10 min.加堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG室溫孵育2 h后，TBST振搖洗膜3次，每次10 min.加顯色液顯色，Tannon凝膠成像系統(tǒng)照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行量化分析.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果均以ˉx±S表示，并采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～4所示.結(jié)果表明，隨著SFN濃度的增加，HepG-2細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)并無(wú)顯著改變;而p-ERK蛋白表達(dá)卻逐漸降低，各組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01).

圖4 SFN對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

SFN具有卓越的化學(xué)預(yù)防作用，其防癌抗癌作用機(jī)制的研究已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn).以往研究表明，SFN可在腫瘤發(fā)生的多個(gè)階段發(fā)揮防癌作用.而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷還可直接殺傷腫瘤細(xì)胞.本文前期研究發(fā)現(xiàn)，SFN可抑制HepG-2細(xì)胞的增殖，并可通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)Bax的表達(dá)進(jìn)而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，最終啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，此為SFN抗人肝癌細(xì)胞增殖的主要機(jī)制［7－8］.

MAPKs家族是細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一.其中，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2是第一個(gè)被克隆的MAPKs家族成員，與細(xì)胞增殖最為密切，是細(xì)胞外多種刺激傳向細(xì)胞內(nèi)的交匯點(diǎn)［10］.大量資料表明，用ERK的顯性失活突變體能夠阻斷Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明ERK還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控.ERK通路可通過(guò)磷酸化p53、增強(qiáng)TNF-α表達(dá)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以參與Bcl-2，Caspase家族介導(dǎo)的凋亡.而本課題研究發(fā)現(xiàn)，SFN可下調(diào)人肝癌HepG-2細(xì)胞內(nèi)p-ERK的表達(dá)進(jìn)而抑制ERK通路.這一結(jié)果說(shuō)明，SFN下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而降低Bcl-2/Bax的比率、促進(jìn)HepG-2細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑凋亡的作用可能與其抑制ERK通路有關(guān).但SFN抑制HepG-2細(xì)胞ERK通路的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

［1］ 季宇彬，鄒 翔，李 雷.十字花科植物中異硫氰酸鹽的性質(zhì)及活性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，23(4):385－390.

［2］ 季宇彬，池文杰，鄒 翔，等.西蘭花中異硫氰酸鹽誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG－2凋亡作用及其機(jī)制的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(7):612－615.

［3］ 季宇彬，武曉丹，鄒 翔.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導(dǎo)HepG－2細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)天然藥物，2007，5(4):293－296.

［4］ 季宇彬，池文杰，鄒 翔，等.西蘭花中蘿卜硫素提取、分離與抗癌活性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，21(3):270－273.

［5］ 鄒 翔，郎 朗，武曉丹，等.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導(dǎo)人胃腺癌SGC－7901細(xì)胞凋亡的初步研究［J］.中草藥，2007，38(2):228－231.

［6］ 孫勝男，鄒 翔，高 鵬，等.萊菔硫烷誘導(dǎo)人肝癌HepG－2細(xì)胞凋亡的p38MAPK途經(jīng)研究［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2009，32(1):29－33.

［7］ 季宇彬，高 鵬，鄒 翔，等.萊菔硫烷通過(guò)線粒體誘導(dǎo)HepG－2細(xì)胞凋亡［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，25(6):641－644.

［8］ 鄒 翔，曲中原，高 鵬，等.萊菔硫烷對(duì)人肝癌HepG－2細(xì)胞Bcl－2與Bax基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，24(2):76－80.

［9］ 鄒 翔，曲中原，高 鵬，等.萊菔硫烷誘導(dǎo)HepG－2細(xì)胞G2/M期阻滯及其對(duì)Cdk1和CyclinB1蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(2):8－12.

［10］ DIASINOU F，PAUL D S，JOHN H B.The 5－HT－and FMRFa－activated signaling pathways interact at the level of the Erk MAPK cascade:Potential inhibitory constraints on memory formation［J］.Neuroscience Letters，2006，396(3):235－240.