蛇足石杉內(nèi)生真菌JSM 09的分離及分子鑒定

譚周才，劉祝祥，賀 樂，向 芬，陳奇輝，石進校

（吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000）

內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）一詞首先是由De Bary在1886年提出，系指生活在植物組織內(nèi)的微生物。Petrini進一步將概念擴展為：生活史中某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的微生物[1]。內(nèi)生真菌，不但能產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學成分，而且，還能夠獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物。從內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中分離出來的生物活性物質(zhì)有51%是新物質(zhì)，具有重要研究價值[2-7]。蛇足石杉的藥效成分石杉堿甲（Huperzine A）臨床上已用于治療各種原因和不同年齡組的老年人記憶減退和早期老年癡呆癥，療效顯著[8]。石杉堿甲化學合成有其難以克服的局限性[9]，天然石杉堿甲主要還是從蛇足石杉等植物中提取。由于石杉堿甲在植物中含量非常低，植物生長緩慢，導致石杉科植物的掠奪式采挖，從而破壞了天然資源的可持續(xù)開發(fā)。因此，通過人工栽培或分離蛇足石杉內(nèi)生真菌，尋找能產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌顯得尤為重要。盡管內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同化學成分，但產(chǎn)量低，難以產(chǎn)業(yè)化，通過栽培藥用植物，滿足市場需求仍然是主要手段。沈曉霞等[10]對蛇足石杉外植體進行組織培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)植株中有內(nèi)源真菌的共生，并標記了內(nèi)源真菌的共生部位。石瑋等[11]從千層塔的莖中分離出4株內(nèi)生真菌，分別屬于頂孢霉屬、單軸霉屬、酵母和青霉屬。黎萬奎等[12]從蛇足石杉中分離出支頂孢屬內(nèi)生真菌菌株能夠產(chǎn)生石杉堿甲，有望成為石杉堿甲新藥源。徐巧玉等[13]對湘西產(chǎn)蛇足石杉內(nèi)生真菌進行了研究，從蛇足石杉中共分離出5株內(nèi)生真菌，其中一株經(jīng)過初步鑒定為枝孢霉。本重點實驗室在開展湘西產(chǎn)蛇足石杉內(nèi)生微生物多樣性研究時，得到一株內(nèi)生真菌，現(xiàn)將分離和鑒定結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 蛇足石杉植株采自湖南古丈縣，采樣時選取健康、生長較為旺盛的植株，采集時帶根部土采集，帶回實驗室后，立即對材料進行內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑 分子生物學試劑購自上海生物工程公司，ITS 擴增和測序引物（ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG）由寶生物工程（大連）公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 將采集的蛇足石杉材料，洗凈后進行表面消毒。表面消毒程序為：75%乙醇浸泡40 s，無菌水沖洗3～4次，0.1%升汞浸泡8 min，無菌水沖洗3～4次，0.3%雙氧水浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次，置于無菌水中準備接種。無菌操作把表面消毒后的蛇足石杉植株用刀片切成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，直接接種于分離培養(yǎng)基上，切口與培養(yǎng)基接觸，同時將最后一次清洗外植體的無菌水按0.1mL/皿涂布于分離培養(yǎng)基上作為對照。將分離平板和對照平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)10～15 d。在培養(yǎng)期間觀察對照平板是否長菌，并將外植體上長出的菌體用接種針依次轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，分別進行編號，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。采用尖端菌絲分離純化的方法，將挑出來的真菌經(jīng)過反復純化，直到得到純化的典型菌落。

1.2.2 內(nèi)生真菌的基因組DNA提取 平板上挑取米粒大小菌絲置于碾缽中，加少許石英砂與600 μL的CTAB溶液勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，置于60℃恒溫水浴鍋中水浴30min。取出離心管，往離心管中加入600μL抽提液（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1）輕搖至勻，4℃、14 000 r/min 離心 10 min。取上清液約300μL，轉(zhuǎn)管再次抽提，直至兩層液相間無白色膜狀物質(zhì)。取離心后的上清液300μL轉(zhuǎn)管，每管中加3 mol/L醋酸鈉約30μL，輕搖至勻，補加-20℃無水乙醇600μL，搖勻后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中冷凍15 min。取出離心管，4℃、14 000 r/min離心10min，棄上清液，留沉淀。向離心管中加入70%乙醇 1mL，4℃、14 000 r/min離心 10 min，倒出上清液，再將離心管中沉淀置于37℃干燥箱中烘干。向烘干后的離心管中加入20μL的TE緩沖液，于4℃保存，待用。

1.2.3 內(nèi)生真菌ITS序列擴增和測序 PCR擴增反應體系：10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL（2.5mM/μL）；Primer1 ITS4 1.0 μL （25 pmol/μL），Primer2 ITS5 1.0 μL（25 pmol/μL）；Taq 酶 0.2 μL（3 U/μL），去離子水37.8μL。

PCR反應條件：預變性溫度95℃ 1 min；變性溫度95℃ 1min，退火溫度51℃ 1min，延伸溫度72℃ 1 min，共35個循環(huán)；35個循環(huán)后再72℃ 延伸10min，反應結(jié)束后，將反應產(chǎn)物4℃保存。按照上述擴增條件進行ITS序列擴增，擴增產(chǎn)物寄上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將測得ITS-5.8S rRNA FASTA格式的序列用NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站提供的BLAST服務，在數(shù)據(jù)庫中搜索高度相似序列，調(diào)取同源性高的相關(guān)序列組成序列集；然后用CLUSTAl X軟件包中的Alignment程序進行多重序列比對，用Trees程序計算序列間的相似性；用BioEdit軟件進行序列剪輯；系統(tǒng)進化距離矩陣根據(jù)Kimura模型估算；用MEGA 4.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis software 4.1）軟件包中相關(guān)程序采用鄰接法（Neighbor-Joining）進行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌JSM 09的分離純化

經(jīng)表面消毒后的外植體接種至培養(yǎng)基上置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～15 d后，可看到外植體切口邊緣有真菌長出，對照培養(yǎng)皿上無菌生長，證明所分離的微生物為內(nèi)生微生物（如圖1）。根據(jù)菌落形態(tài)、菌落正反面顏色等特征將菌落挑出并編號，采用尖端菌絲分離純化法，將挑出來的真菌經(jīng)過反復純化，察氏培養(yǎng)基分離得到16株，PDA培養(yǎng)基分離得到66株，共得到82株純化的典型真菌菌落，其中一株真菌編號為JSM 09。

圖1 內(nèi)生真菌分離照片

2.2 內(nèi)生真菌JSM 09的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

按照上述方法對內(nèi)生真菌JSM 09的ITS進行測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，JSM 09的ITS序列如下：

以非褶菌目Antrodiella屬（小薄孔菌屬）的Antrodiella citronella菌株為外群，JSM 09基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，與Antrodiella屬同屬非褶菌目的Irpex屬（耙齒菌屬）菌株都聚類在系統(tǒng)發(fā)育樹一個大枝上，Irpex屬的3個不同種菌株在這個大枝上又形成3個獨立穩(wěn)定的小枝，而菌株JSM 09和Irpex屬的3個Irpex lacteus菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，聚在同一個小枝上，且與Irpex lacteus XSD-2距離最近，相似程度為99%。因此，從系統(tǒng)發(fā)育分析來看，JSM 09應為Irpex lacteus。

圖2 JSM 09基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

以湘西產(chǎn)蛇足石杉為材料，經(jīng)過嚴格的表面消毒，從蛇足石杉內(nèi)分離純化得到1株內(nèi)生真菌JSM 09。對JSM 09進行基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：菌株JSM 09和Irpex屬的3個Irpex lacteus菌株聚在一個枝上，且與Irpex lacteus XSD-2距離最近，相似程度為99%，JSM 09鑒定為白耙齒菌（Irpex lacteus）。耙齒菌屬（Irpex）由Fries建立，目前在我國報道的有3個種[14]。白耙齒菌菌絲發(fā)酵產(chǎn)物，臨床上用來治療因腎小球腎炎所導致的尿少、腰痛、血壓升高等癥狀，能明顯消除或減少慢性病人的尿蛋白、紅細胞，因此，該菌株有一定利用價值[15]。白耙齒菌原本是森林木材的腐生菌，作為內(nèi)生真菌被首次報道，腐生真菌作為內(nèi)源真菌存在于健康植物當中，其生態(tài)功能如何，值得進一步研究。

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