煙草根系腐解液對(duì)萵苣的化感作用

牛麗娜，周冀衡，柳 均

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

植物化感作用（Allelopathy）又稱植物生化他感作用或他感作用，是指植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，通過排出體外的代謝產(chǎn)物改變其周圍的微生態(tài)環(huán)境，從而產(chǎn)生的植物自身與其他有機(jī)體之間在同一生長(zhǎng)環(huán)境中相互排斥或促進(jìn)的一種自然現(xiàn)象[1-2]。煙草屬于不耐連作的作物。長(zhǎng)期以來，連作障礙給煙葉生產(chǎn)帶來的危害十分嚴(yán)重，已成為影響和制約我國(guó)優(yōu)質(zhì)煙草生產(chǎn)的重要問題[3]。研究顯示，化感作用是引起煙草連作障礙的重要因素。因此，解決煙草連作障礙的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，就是克服化感物質(zhì)對(duì)煙草的影響。當(dāng)土壤中具有一定濃度的化感物質(zhì)后，可能對(duì)下茬作物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。研究表明[1,4-5]，植物大部分有效化感物質(zhì)是通過殘?bào)w和殘茬腐解釋放的次生代謝物質(zhì)。煙草生產(chǎn)過程中，埋在地下的根系部分，受到土壤表層較高濕度及較少光照的影響，很容易腐爛分解，殘留在田間。煙草根系腐解后的產(chǎn)物是否會(huì)在田間形成化感物質(zhì)，從而對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響，尚未見報(bào)道。本文以萵苣種子作為受體材料，研究探討了煙草生長(zhǎng)殘留的根系腐解液對(duì)萵苣種子的化感作用，希望為進(jìn)一步克服煙草生產(chǎn)中的連作障礙提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草凋萎根系早期腐解液的制備

參照廖周瑜等的方法[6]，取湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園煙草種植基地的0～20 cm表層土壤，去除雜質(zhì)，風(fēng)干后碾碎過60目篩，土樣備用。采集煙草K326（Nicotiana tobacumL.K326）無病斑凋萎根系足量，風(fēng)干后剪碎，隨機(jī)稱取兩份25 g樣品，紫外線殺菌3 h后，加入25 g上述土樣混勻，再加少許無菌水，置入250 mL三角瓶中于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)遮光腐解；45 d后，加入適量的無菌水提取48 h，經(jīng)過抽濾，蒸餾水定容至250 mL，得質(zhì)量濃度為0.100 g/mL的煙草凋萎根系早期腐解液。

取部分腐解液，用無菌去離子水分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.050 g/mL、0.010 g/mL和0.005 g/mL 3個(gè)濃度梯度。對(duì)照組為無菌去離子水。

1.2 煙草凋萎根系早期腐解液各組分的分離制備

按照郭亞利等的方法[7]，將上述0.100 g/mL濃度的腐解液離心（4 000 r/min，20 min），取 100 mL上清液用0.10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至11.0，用等體積的無水乙醚萃取3次，收集上層乙醚相，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用去離子水定容至100 mL即為濃度FW（鮮質(zhì)量）0.100 g/mL堿溶性組分。剩下的水相再用0.10 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0后，再用等體積的無水乙醚萃取3次，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用去離子水定容至100mL即為0.100 g/mL酸溶性組分；剩下的水相再用0.10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.0，用相同的方法得到中性組分。分別置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述各組分液分別用無菌去離子水稀釋至0.050 g/mL、0.010 g/mL和0.005 g/mL 3個(gè)濃度梯度。共得4個(gè)濃度梯度組成的3種組分的處理液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與生物活性檢測(cè)

1.3.1 生物活性檢測(cè)裝置的改進(jìn) 試驗(yàn)中萵苣種子生長(zhǎng)迅速，一般的培養(yǎng)皿空間較難滿足其生長(zhǎng)的需要，因此對(duì)培養(yǎng)皿做了改進(jìn)：超凈工作臺(tái)下，選取兩個(gè)相同規(guī)格的無菌培養(yǎng)皿皿蓋或皿盤，使選取的皿蓋/皿盤能組合配套。其中一個(gè)皿蓋/皿盤內(nèi)鋪有殺菌后的雙層濾紙。將萵苣種子均勻播種于雙層濾紙上，然后均勻加入目標(biāo)溶液，再將對(duì)應(yīng)的皿蓋/皿盤蓋于播好種的皿蓋/皿盤上，用殺菌后的透明膠帶封閉兩皿蓋/皿盤間的縫隙，使其形成無菌環(huán)境，最后將其置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 生物活性檢測(cè) 采用培養(yǎng)皿濾紙法[8-11]進(jìn)行生物活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)前，將培養(yǎng)皿及定性濾紙置于烘箱內(nèi)120℃消毒滅菌2～4 h。

選取均勻飽滿的萵苣種子，用10%的次氯酸鈉溶液殺菌10min，用無菌水清洗3次，晾干備用。將消毒后的萵苣種子均勻播入上述處理的鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿紙床上，每皿放置25粒，分別加入上述煙草凋萎根系早期腐解液及其不同組分4個(gè)濃度的提取液5mL，對(duì)照組加入5mL的無菌去離子水，3次重復(fù)。光照培養(yǎng)箱內(nèi)（光強(qiáng)6 000 lx，光照12 h/d，濕度50%，箱溫恒定25℃）培養(yǎng)。每隔24 h觀察種子萌發(fā)狀況，以子葉露出或胚根長(zhǎng)度≥1 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，7 d后統(tǒng)計(jì)種子最終萌發(fā)率，并測(cè)定各處理萌發(fā)種子幼苗的胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)及其鮮重和干重[12-13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析及化感潛力評(píng)價(jià)

采用Microsoft Excel 2003及SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。生物活性檢測(cè)試驗(yàn)計(jì)算公式參照 Saxena等[14]的方法，見式（1）~式（4）。

上式中，GR表示種子萌發(fā)率，G表示種子萌發(fā)數(shù)；RG表示種子萌發(fā)速率；Di表示天數(shù)，Ni表示第i天的發(fā)芽數(shù)；MPUG表示平均萌發(fā)周期；UG表示最終萌發(fā)率，即試驗(yàn)過程中，最大平均種子萌發(fā)率；PI表示種子萌發(fā)抑制率，PS表示種子萌發(fā)促進(jìn)率，UG（CK）表示對(duì)照組處理后的最終萌發(fā)率，UG（AE）表示經(jīng)處理后的最終萌發(fā)率。

化感效應(yīng)指數(shù)（RI）采用Williamson[15]的方法，見式（5）。

式中，C為對(duì)照值，T為處理值。當(dāng)RI＞0時(shí)，表示促進(jìn)作用；當(dāng)RI＜0時(shí)，表示抑制作用。

2 結(jié)果分析

2.1 煙草凋萎根腐解液及其組分對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響

對(duì)照組的最終萌發(fā)率為（98.67±2.31）%。除腐解原液和中性組分的0.005 g/mL處理組未降低萵苣種子的最終萌發(fā)率外，煙根腐解原液及其組分各濃度處理均降低了萵苣種子的最終萌發(fā)率（表1）。隨著煙根腐解原液、中性組分各處理濃度的增加，萵苣種子最終萌發(fā)率逐漸降低。其中，中性組分0.100 g/mL處理中萵苣種子的最終萌發(fā)率與對(duì)照組達(dá)到極顯著差異水平。酸溶性組分各濃度處理對(duì)萵苣種子最終萌發(fā)率的影響呈現(xiàn)單峰現(xiàn)象，即中間濃度處理的萵苣種子最終發(fā)芽率較兩端濃度處理的高。堿溶性組分的影響規(guī)律不明顯。4種組分處理內(nèi)，各濃度間，腐解原液、酸溶性組分差異不顯著；中性組分3組低濃度處理差異不顯著，但0.100 g/mL處理組與這3組差異極顯著；堿溶性組分除0.100 g/mL處理組與其他3濃度處理組差異顯著外，其他3組差異不顯著。4組處理液條件下，煙根腐解原液及其組分各濃度處理對(duì)萵苣種子的萌發(fā)均呈現(xiàn)抑制作用，其抑制效應(yīng)與對(duì)萵苣種子最終萌發(fā)率的影響規(guī)律相似，其中腐解原液和中性組分的0.005 g/mL處理組對(duì)萵苣種子的萌發(fā)并沒有抑制作用。

表1 煙根腐解液及其組分對(duì)萵苣種子萌發(fā)參數(shù)的影響

煙根腐解原液及其組分各濃度處理均降低萵苣種子萌發(fā)速率，延長(zhǎng)了種子的平均萌發(fā)周期（表1）。其中，腐解原液0.100 g/mL處理組，中性組分和堿溶性組分0.100 g/mL和0.050 g/mL處理組的萵苣種子萌發(fā)速率與對(duì)照組差異達(dá)極顯著水平，中性組分0.010 g/mL處理與對(duì)照組達(dá)顯著水平。煙根腐解原液及其組分各濃度處理隨濃度的增加延長(zhǎng)了種子平均萌發(fā)周期，但延長(zhǎng)的幅度并不大，只有在中性組分0.100 g/mL處理和堿溶性組分0.050 g/mL、0.100 g/mL等較高濃度處理組的種子平均萌發(fā)周期延長(zhǎng)至2.23 d以上，其他各組濃度下對(duì)種子平均萌發(fā)周期的影響與萌發(fā)速率之間呈正相關(guān)關(guān)系。即，低濃度處理對(duì)種子萌發(fā)周期影響小，高濃度處理影響大。

2.2 煙草凋萎根腐解液及其組分對(duì)萵苣幼苗生長(zhǎng)的影響

和對(duì)照組相比（表2），煙根腐解原液和堿溶性組分中，除腐解原液0.100 g/mL處理對(duì)萵苣幼苗胚軸長(zhǎng)度有促進(jìn)作用（RI=0.17）、堿溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）有促進(jìn)作用（RI=0.14和0.09）外，其余各組各濃度處理均表現(xiàn)為抑制作用。其中，酸溶性組分和中性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）的抑制作用達(dá)顯著或極顯著水平。腐解原液各濃度處理隨處理濃度的增加逐漸由抑制作用轉(zhuǎn)為促進(jìn)作用（-0.11≤RI≤0.17），各濃度處理間差異不顯著；酸溶性組分和中性組分各濃度處理抑制作用隨著濃度的增加先降低后增加；堿溶性組分各濃度處理隨著濃度的增加逐漸由抑制作用轉(zhuǎn)為促進(jìn)作用（-0.28≤RI≤0.14）。

表2 煙根腐解液及其組分對(duì)萵苣幼苗生長(zhǎng)的影響

和對(duì)照組相比，煙根腐解原液除0.050 g/mL處理抑制萵苣幼苗胚根生長(zhǎng)外，其余各濃度均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，且以0.010 g/mL處理促進(jìn)作用最大（RI=0.35），組內(nèi)規(guī)律性不明顯；酸溶性組分和中性組分除0.010g/mL處理表現(xiàn)為輕微的促進(jìn)作用（RI=0.14和0.01）外，其余各濃度均表現(xiàn)為明顯的抑制作用，其中高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）抑制作用與對(duì)照組差異顯著或極顯著，組內(nèi)的規(guī)律性表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制的趨勢(shì)；堿溶性組分各濃度處理均表現(xiàn)為抑制作用，其中高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）抑制作用與對(duì)照組差異極顯著或顯著，其作用的規(guī)律性不明顯，以0.050 g/mL處理的抑制作用最強(qiáng)（RI=-0.67）。

2.3 煙草凋萎根腐解液及其組分對(duì)萵苣幼苗物質(zhì)積累的影響

雖然堿溶性組分各濃度處理對(duì)胚根生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用，但由于其高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）對(duì)胚軸的促進(jìn)作用，使得堿溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）對(duì)萵苣幼苗鮮重有促進(jìn)作用（表3）。除此之外，其他各組各濃度處理均表現(xiàn)為抑制作用。隨濃度的增加腐解原液對(duì)萵苣幼苗鮮重的抑制作用先增強(qiáng)后減弱；酸溶性組分和中性組分的抑制作用則表現(xiàn)為先減弱后增強(qiáng)，其中酸溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）與對(duì)照組達(dá)極顯著差異水平；堿溶性組分作用規(guī)律不明顯。煙根腐解液及其組分各處理對(duì)萵苣幼苗干重的影響不顯著，各組內(nèi)各濃度間差異均不顯著。

2.4 煙草根系腐解液及其組分的綜合化感效應(yīng)分析

煙草根系腐解液對(duì)萵苣種子具有化感抑制作用，且不同組分不同濃度處理?xiàng)l件下，化感作用不同，尤其以酸溶性組分0.100 g/mL處理的化感抑制作用最為強(qiáng)烈（表4）。總體來看，煙草根系腐解液的化感抑制強(qiáng)度為：酸溶性組分＞中性＞堿溶性組分＞腐解原液。

表3 煙根腐解液及其組分對(duì)萵苣幼苗物質(zhì)積累的影響

表4 煙根腐解液及其組分的綜合化感效應(yīng)強(qiáng)度

3 結(jié)論

煙草根系腐解后的腐解物及其不同組分對(duì)萵苣種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用，降低了萵苣種子的萌發(fā)速率，延長(zhǎng)了種子的萌發(fā)周期。試驗(yàn)表明，煙草根系腐解后對(duì)萵苣種子萌發(fā)及生長(zhǎng)具有化感作用，這與前人在其他作物上的研究相一致[16]，同時(shí)證實(shí)了煙草根系腐解過程中可形成對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有明顯抑制作用的化感物質(zhì)。

化感效應(yīng)的強(qiáng)弱根據(jù)煙根不同組分以及處理濃度的不同而不同，由于試驗(yàn)過程中處理的條件限制，無法對(duì)其進(jìn)行精細(xì)的比較，但從總體的表現(xiàn)來看，煙根腐解物對(duì)萵苣種子的化感效應(yīng)主要規(guī)律為：酸溶性組分＞中性＞堿溶性組分＞腐解原液。其中，酸溶性組分對(duì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制作用隨濃度的增加而增加，這與前人研究相吻合[17]。同時(shí)，腐解原液、中性組分和堿溶性組分在不同處理濃度中的表現(xiàn)規(guī)律雖存在差異，但均不同程度地抑制了萵苣種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。以上情況說明，煙根腐解液在較寬的pH范圍內(nèi)均有抑制種子萌發(fā)的化感物質(zhì)存在，酸溶性化感物質(zhì)是殘?bào)w腐解物產(chǎn)生化感抑制作用的主體。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，煙葉采收結(jié)束后，殘留的煙根極易腐爛在田間，土壤中的微生物短時(shí)間內(nèi)可以通過腐解作用，將這些煙根所含有的化感物質(zhì)釋放出來。因此，如不很好地處理這類殘?bào)w物質(zhì)將對(duì)煙草生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的影響。在煙草產(chǎn)區(qū)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行煙草各項(xiàng)農(nóng)藝措施的實(shí)施，精細(xì)化生產(chǎn)，妥善處理和及時(shí)清除煙區(qū)煙草殘?bào)w物質(zhì)，防止其在田間地頭腐解，產(chǎn)生化感物質(zhì)，從而對(duì)煙草生長(zhǎng)產(chǎn)生自毒作用，進(jìn)而阻礙連作。

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