高速逆流色譜法分離前胡提取物中香豆素類成分

蔡海林，杜良偉，劉祥英，陳桂華，王彥輝，柏連陽,3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.廣西大學 化學化工學院，廣西 南寧 530004；3.湖南人文科學技術學院，湖南 婁底 417000）

對白花前胡（Peucedanum praeruptorumDunn.）功能成分的提取主要采用水煎煮、乙醇加熱回流法等，利用效率不高[1]，而對前胡提取物的分離則主要采用硅膠柱層析、制備液相色譜分離等技術[2]，成本較高，制備量小，過程復雜，不適合大規(guī)模的分離制備。為了彌補上述方法的不足，筆者采用CO2超臨界流體萃取對樣品所含香豆素類功能成分進行初提后，用硅膠柱對初提物進行第一步分離，再用高速逆流色譜（HSCCC）[3]對目標成分實現(xiàn)細分，并得到單體化合物。

1 材料與方法

1.1 材 料

前胡購自湖南省藥材公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥大學于永秩教授鑒定確認為傘形科白花前胡。

主要儀器：HPTLC薄層色譜儀（德國CAMAG公司）；HL-1L/40-A型超臨界萃取儀（杭州華黎泵業(yè)有限責任公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；島津 Uvmini-1240紫外分光光度計（日本島津公司）； TBE-300A高速逆流色譜儀（上海同田生化技術有限公司）；島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）； Varian INOVA-300核磁共振儀（瑞士Broker公司）。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

前胡洗凈后自然陰干，機械粉碎。取粉碎的前胡根莖2.0 kg，以1∶1的比例用無水乙醇浸泡24 h，采用CO2超臨界流體萃取其中的香豆素類成分，萃取溫度60 ℃，萃取壓力35 MPa，萃取時間60 min，CO2動態(tài)流量2 kg/h。

精確稱取前胡CO2超臨界萃取物10 g（相當于前胡粉碎物200 g），用丙酮溶解后，加入100 g硅膠拌勻；硅膠柱柱徑8 cm，柱長120 cm，硅膠1 500 g，石油醚濕法裝柱，裝柱后反復用石油醚沖洗，濕法上樣。利用薄層層析色譜（TLC）試驗確定石油醚∶乙酸乙酯體系為硅膠柱分離的洗脫系統(tǒng)。

收集分離組分：每100 mL收集1份，流速控制在0.08 BV/h（100 mL/h），分步收集，以薄層層析結(jié)合5%三氯化鐵甲醇溶液顯色，監(jiān)測柱層析各分離組分中成分的變化，調(diào)整洗脫比例。

1.2.2 高速逆流色譜分離

1） 溶劑系統(tǒng)的選擇。根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是樣品在兩相中具有合適的分配系數(shù)（0.5＜K＜2.0）[6]，可用HPLC、EC、TLC測定[7]。本試驗選用HPLC測定，共考察了7個溶劑系統(tǒng)，分別是：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶1∶1∶1 ，正己烷∶乙酸乙酯∶乙腈∶甲醇=5∶2∶5∶4，正己烷∶乙醇∶水=6∶5，正己烷∶乙腈∶氯仿=5∶5∶1，正己烷∶乙腈=1∶1，石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶5∶4，石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶5∶2。

2） 高速逆流色譜分離初提物。將待測溶劑加入分液漏斗中，充分振搖后靜置24 h分相，上相為固定相，下相為流動相，上、下相超聲脫氣20 min，測定其固定相保留率?？紤]到樣品濃度高固定相易流失的因素，將樣品用等體積的上相和下相溶解，盡可能用大體積稀釋樣品進樣。HSCCC主機轉(zhuǎn)速為850 r/min，流動相流速為2.0 mL/min，254 nm波長檢測，根據(jù)色譜圖手動收集各色譜峰組分。

3） 檢測各組分純度。采用HPLC檢測經(jīng)HSCCC分離后各組分的純度。HPLC分析條件：流動相為甲醇∶水，梯度洗脫：0 min、0 甲醇→70 min、100%甲醇；流速0.8 mL/min；檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃ 。

1.2.3 鑒定單體化合物結(jié)構

將分離所得單體化合物冷凍干燥，利用核磁共振（NMR）檢測并鑒定其結(jié)構。

2 結(jié)果與分析

2.1 初提物的初步分離

超臨界 CO2萃取白花前胡甲素提取率平均為2.66%，高于采用乙醇加熱回流法1.81%的提取率。根據(jù)香豆素類化合物已知的各種理化特征，以石油醚∶乙酸乙酯體系為洗脫系統(tǒng)，硅膠柱分離共收集520個組分，經(jīng)過TLC檢測，合并相同組分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，共得到14種分離組分，其中A2、A4、A6、A13組分在365 nm紫外燈照射下呈亮藍色，具備香豆素類成分的顯著特征[8]，將這4個組分混合后作為樣品（記為B1）進行HSCCC分離。

2.2 高速逆流色譜分離結(jié)果

2.2.1 溶劑系統(tǒng)的確定

根據(jù)表1的K值結(jié)果，選擇石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水= 5∶5∶5∶4作為溶劑體系進行 HSCCC分離。該溶劑體系HPLC色譜圖見圖1、圖2。

2.2.2 HSCCC分離功能成分

選擇石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶5∶4作為溶劑體系進行HSCCC分離，共得到4個組分（圖3），通過HPLC檢驗，化合物 Ⅰ （12.0 mg）、化合物 Ⅱ （10.5 mg）、化合物III（5.8 mg）、化合物IV（4.6 mg）純度分別達到了97.6%、98.1%、95.8%、95.2%，可以用作單體化合物的結(jié)構鑒定。

表1 各溶劑體系K值Table 1 K values of different solvent system

圖1 上相溶解樣品液相色譜Fig.1 Chromatogram of sample distribution in upper solvent used for HSCCC by HPLC

圖2 下相溶解樣品液相色譜Fig.2 Chromatogram of sample distribution in lower solvent used for HSCCC by HPLC

圖3 HSCCC分離效果Fig.3 HSCCC chromatogram

2.3 結(jié)構鑒定

通過核磁共振（NMR）對4種化合物進行結(jié)構鑒定，解析結(jié)果如下。

化合物Ⅰ：1HNMR（300MHz，CDCl3） δppm: 7.61 （1H，d，J=9.6Hz），7.38（1H，d，J=8.7Hz），6.83（1H，d，J=8.7Hz），6.28 （1H，d，J =5.1Hz）， 6.23（1H，d，J=9.6Hz），6.07（1H，br.q，J=7.2Hz），5.33（1H，d，J=5.1Hz），2.11（3H，s），2.01（3H，d，q，J= 7.2，1.8Hz），1.84 （3H，t，J=1.5Hz），1.46（3H，s） ，1.39（3H，s）；13CNMR（300 MHz，CDCl3）δ ppm: 169.4，166.2，159.8，156.5，154.2，143.2，138.9，129.1，127.1，114.5，113.2，112.5，106.7，77.1，71.7，63.0，23.8，23.5，20.7，20.4，15.7。

該化合物與已知化合物前胡香豆素Ⅱ的波譜數(shù)據(jù)[9]一致，確定化合物Ⅰ為前胡香豆素Ⅱ。

化合物Ⅱ：1HNMR（300MHz，CDCl3）δ ppm: 7.61（1H，d，J=9.6Hz），7.38（1H，d，J=8.4Hz），6.82（1H，d，J= 8.4Hz），6.63 （1H，d，J=5.1Hz），6.21 （1H，d，J= 9.6Hz），6.02（1H，br.，q，J=7.2Hz），5.34（1H，d，J= 5.1Hz），2.09（3H，s），2.00（3H，br.d，q，J=7.2，1.8Hz），1.87 （3H，m，J=1.5 Hz），1.47（3H，s），1.44 （3H，s）；13CNMR （300MHz，CDCl3）δ ppm: 169.8，166.9，159.7，156.6，154.0，143.2，137.7，129.2，127.4，114.4，113.2，112.5，107.2，77.2，70.5，60.1，25.3，22.1，20.7，20.3，15.5。綜合分析化合物Ⅱ為北美芹素[10-11]。

化合物III：1H-NMR（300MHz，CDCl3）δ ppm：6.24（1H，d，J=9.6Hz，3-H），7.60（1H，d，J=9.6Hz，4-H），7.35（1H，d，J=8.7Hz，5-H），6.80 （1H，d，J= 8.7Hz，6-H），1.479 （3H，s，2’-CH3），1.437 （3H，s，2’-CH3），5.41（1H，d，J= 4.8Hz，3’- H），2.11 （3H，s，2’’-CH3），6.13（1H，m，3’’’-H），1.87 （3H，m，4’’’-CH3），1.96（3H，d，q，5’’’- CH3）；13C-NMR（300 MHz，CDCl3）δ ppm：159.8 （C-2），113.1（C-3），143.2（C-4），129.1 （C-5），114.3 （C-6），156.7 （C-7），107.0（C-8），153.9 （C-9），112.4 （C-10），77.6（C-2’），69.7 （C-3’），61.0（C-4’），24.8（C-2’-CH3），22.9 （C-2’-CH3），169.8（C-1’’），20.6（C-2’’），166.4 （C-1’’’），126.9（C-2’’’），139.8（C-3’’’），15.7 （C-4’’’），20.4（C-5’’’）。綜合分析化合物III為白花前胡甲素[12]。

化合物IV：1H-NMR（300MHz，CDCl3）δ ppm：6.37 （1H，d，J=9.6Hz，3-H），7.79（1H，d，J=9.3Hz，4-H），7.69（1H，s，5-H），7.48（1H，s，8-H），7.70（1H，d，J=2.1Hz，2’-H），6.83（1H，dd，J=2.4Hz，3’-H）；13C-NMR （300MHz，CDCl3） δ ppm：161.0（C-2），114.6（C-3），144.0（C-4），119.8（C-5），124.8 （C-6）， 156.4（C-7），99.8 （C-8），152.0 （C-9），115.4 （C-10），146.8（C-2’），106.3（C-3’）。綜合分析化合物IV為補骨脂素[13]。

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英文編輯：易來賓