豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒河南09分離株ORF5基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析

楊春華，韓志濤，胡慧，鐘毅，王冬，祝建新*

（1.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江西 南昌 330002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病[1]。PRRSV包括2個(gè)基因亞型，分別為以ATCC VR-2332株為代表的美洲型和以LV株為代表的歐洲型。中國的多是美洲型，且存在變異株[2-3]。該病 1987年在美國首次報(bào)道，現(xiàn)已遍及世界各地，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)。目前該病毒已成為中國豬病的主要病原之一[4-6]。2006年以來由PRRSV變異株引起的“高熱病”給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。PRRS與 PCV-2、CSFV、PRV等病毒的混合感染也時(shí)有發(fā)生，使該病變得更為復(fù)雜[2]。PRRSV基因組大小約為15 kb，包括9個(gè)開放閱讀框架，可編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白（又稱gp5或E蛋白）是該病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是一種多功能性蛋白[9]。不同國家和地區(qū)分離株的ORF5基因差異較大，已有利用其序列差異性來研究PRRSV遺傳進(jìn)化的報(bào)道[10-13]。不同PRRSV分離株在毒力、基因序列和抗原性等方面都存在較大差異，找出各株之間的關(guān)系和變異規(guī)律，已成為當(dāng)前研制PRRSV疫苗和了解PRRSV致病機(jī)理及流行趨勢(shì)的關(guān)鍵。2009年，河南省北部暴發(fā)了以“藍(lán)耳病”癥狀為特征的疫情。為探尋引起該病的病原，從河南省漯河市某豬場(chǎng)采集了臨床診斷為感染PRRSV的病料，對(duì)PRRSV的ORF5基因進(jìn)行克隆、序列和結(jié)構(gòu)分析，并與往年分離提取的幾種分離株的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，在GeneBank查詢并下載了河北、山東、山西、安徽、黑龍江等省和典型美洲型的19個(gè)ORF5序列，利用DNASTAR軟件對(duì)以上序列進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 病料采集及預(yù)處理

病料采自河南省漯河市某豬場(chǎng)，臨床檢測(cè)初步診斷為PRRSV感染。無菌條件下取病死仔豬的淋巴結(jié)、肺臟、脾臟等，剪碎，加入適量的PBS液研磨，將研磨后的樣品移入1.5 mL的離心管中，－20℃保存，備用。

1.2 主要試劑及儀器

pGEM-T Easy載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4DNA連接酶均購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）購自大連寶生物公司，DNA凝膠回收試劑盒購自杭州維特潔生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物公司。PCR 儀（PTC 200）為美國MJ公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑及儀器均由河南省動(dòng)物性食品安全實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) GenBank發(fā)表的PRRSV的ORF5基因序列，應(yīng)用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物。上游引物P1：5′-CCGTTGTAGCTTGTCTTT-3′；下游引物P2：5′-GGCGTGTAGATACTGGAA-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 疑似PRRS病料RNA的提取

用Invitrogen公司的TRIzol試劑，按其說明書和文獻(xiàn)[14]的方法提取病毒總 RNA。提取的 RNA用20 μL無RNase水溶解沉淀，－20 ℃保存，備用。

1.5 模板cDNA的制備和PCR

以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 置于－20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）4 μL，dNTPs 3 μL （25 mmol/ μL），Taq酶1 U，引物為1 μL（50 pmol/μL），反轉(zhuǎn)錄cDNA液5 μL。最后用雙蒸水補(bǔ)至50 μL，將EP管置PCR儀，按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 目的基因的克隆

以合成的cDNA為模板，用合成的上、下游引物擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后將目的片段與pGEM-T Easy載體連接，將其轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞[12]，挑取疑似陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

1.7 核酸序列測(cè)定及分析

將鑒定正確的重組菌液送大連寶生物公司測(cè)序，并利用 DNAstar軟件，將所測(cè)核酸序列與GenBank上登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析。

1.8 GP5蛋白結(jié)構(gòu)分析

用ANTHEPROT對(duì)河南09分離株HN-09株和美洲型AF494042株編碼的GP5蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV的ORF5全基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的總RNA作為模板，用設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均獲得了約721 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1），與預(yù)期擴(kuò)增的DNA片段大小相符。

圖 1 PRRSV的ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of ORF5 gene of PRRSV

2.2 ORF5基因的克隆與酶切鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接、轉(zhuǎn)化后，篩選陽性重組菌，提取質(zhì)粒[13]。以該質(zhì)粒為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約721 bp的目的片段（圖2）；對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，所得片段與預(yù)期片段的大小相符（圖3），表明目的基因已插入到載體中。

圖 2 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR result of recombinant plasmid

圖 3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Result of recombinant plasmid by restriction endonclease

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2.3 PRRSV的ORF5基因同源性分析

本試驗(yàn)擴(kuò)增出了PRRSV的ORF5基因，片段長(zhǎng)度為721 bp，命名為HN-09，其中，603 bp的堿基編碼GP5蛋白序列。由表1可見，該分離株與山西分離株的同源性最高，為99.2%，它們之間的親緣關(guān)系較近。與典型美洲型AF494042株核苷酸的同源性為 93.5%；與山東分離株 GU977232和FJ765744的同源性分別為98.8%和98.7%，遺傳關(guān)系也較近；與河南2004年2個(gè)分離株的同源性較低，均為88.7%，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。核苷酸進(jìn)化樹（圖4）也反映出了與此相同的結(jié)果。

表1 PRRSV不同分離株ORF5的核苷酸序列同源性Table 1 Homology analysis of ORF5 nucleotide sequence of PRRSV of different strains

圖4 不同地區(qū)分離株ORF5核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogentic tree of ORF5 nucleotide sequence of strains from different regions

2.4 PRRSV的ORF5基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖4中，各分離株均屬于美洲型的變異毒株，其中，HN-09株與山西株 FJ895329及山東株FJ765744、GU977232的同源性最高，處于進(jìn)化樹的同一個(gè)分支上；與河南省 2004年分離的毒株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，處于不同的亞型。

2.5 ORF5編碼蛋白質(zhì)的組成分析

經(jīng)分析，HN-09株的GP5蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大約為2.2×104，與美洲型相比變化不大。不同氨基酸的含量有所變化，其中含量變化較小的氨基酸有Leu、Gys、Asp、Lys、Pro、Trp；含量增加的有Ala、His、Ile、Asn、Gln、Tyr；含量下降的有Glu、Phe、Gly、Arg、Ser、Thr、Val。HN-09株中亮氨酸（Leu）含量最高達(dá)14%，其次是Val和Ala，含量分別為9.0%和8.5%。中性氨基酸中Cys、Ser、Thr的含量較高，為 5%～7.5%，酸性氨基酸（Asp、Glu）和堿性氨基酸（His、Lys）的含量相當(dāng)，為3%左右。

2.6 ORF5編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。由于HN-09株中堿基的突變，造成其氨基酸序列與美洲型有所不同，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的差異，但二級(jí)結(jié)構(gòu)元件大致分布與美洲型相同，β折疊和β轉(zhuǎn)角主要分布在N端和中間部分，α螺旋主要分布在中間及C端。該蛋白在N端存在3個(gè)潛在的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，分別在第25～27位、第28～30位和第33～35位。

3 結(jié)論與討論

河南PRRSV HN-09株ORF5基因全長(zhǎng)為721 bp，其中編碼GP5蛋白的ORF為603 bp，共編碼200個(gè)氨基酸殘基。該毒株的ORF5序列與山東、山西的同源性較高，為 99.2%～99.8%。與其他不同地方近幾年的分離株同源性也較高，為93.4%～ 98.7%；與美洲型AF494042的同源性為93.5%，各地分離株與美洲型的同源性為93.4%～96.7%；與河南2004年分離株的同源性較低，為88.7%。近幾年河南省流行的 PRRSV毒株與周邊省份分離的毒株均為美洲型變異株，具有高致病性的生物學(xué)特征。雖然與各地分離株的ORF5都有一定的差異，但總體變異不大，引起2009年河南漯河該豬場(chǎng)PRRS疫情的原因可能來自疫苗株變異或在豬體內(nèi)毒力返強(qiáng)。

本試驗(yàn)中分離的HN-09株序列編碼200個(gè)氨基酸殘基，其編碼的GP5蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大約為2.2×104。信號(hào)肽序列位于N端變異區(qū)內(nèi)，其切割位點(diǎn)可能在第 33～35位（N）。二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊含量最高達(dá)41%，無規(guī)則卷曲含量較少，為14%，與美洲型AF494042相比，β轉(zhuǎn)角數(shù)量有所減少，β折疊和無規(guī)則卷曲含量增加。變化主要分布在 N端（前74個(gè)氨基酸），而在第74位氨基酸以后，HN-09株和美洲型的氨基酸序列基本一致，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)量和分布大致相同，說明該分離株所編碼的GP5的主要功能區(qū)域氨基酸殘基沒有發(fā)生較大的變異，不影響該蛋白在病毒粒子中的功能。由于氨基酸中Ala、Asn、Pro等的含量增加，Gly、Ser、Thr等的含量減少，導(dǎo)致β轉(zhuǎn)角的數(shù)量減少，β折疊、無規(guī)則卷曲數(shù)量增加。在第 9位上氨基酸殘基由Gly變?yōu)镃ys，導(dǎo)致此部位的β轉(zhuǎn)角變成β折疊；第29位的Gly變?yōu)锳la、第30位的Ser變?yōu)锳sn，在此形成α螺旋結(jié)構(gòu)；在第58位由Lys變成Gln后，α螺旋斷裂，形成無規(guī)則卷曲，并在第61位和第62位出現(xiàn)一個(gè)β轉(zhuǎn)角。由這些變化可推測(cè)，HN-09株的突變主要集中在N端。此區(qū)域可能包含了一個(gè)信號(hào)肽序列，至于信號(hào)肽區(qū)的改變對(duì)該蛋白產(chǎn)生的影響，還需進(jìn)一步研究。

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英文編輯：羅文翠