百合抗尖孢鐮刀菌無性系的離體篩選

丁丁，呂長(zhǎng)平，王繼華，崔光芬，吳學(xué)尉，張藝萍*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205；2.云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650205；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

百合是世界上重要的商品花卉之一，近年來的生產(chǎn)和消費(fèi)呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球百合種球的貿(mào)易額達(dá)20多億美元[1]。病蟲害問題一直是制約切花百合質(zhì)量提高的首要因素。由尖孢鐮刀菌百合?；停‵usarium oxysporumf. sp.lilii）土傳真菌引起的枯萎病是百合最嚴(yán)重的土傳病害之一[2]，在全世界百合種植區(qū)均有感染和為害。為有效控制百合枯萎病，多年來，國(guó)內(nèi)外科研工作者對(duì)這種病害的病原生物學(xué)、病害流行學(xué)、防治方法等進(jìn)行了研究，摸清了百合枯萎病菌的習(xí)性和枯萎病的發(fā)生規(guī)律，認(rèn)為選育和合理利用抗病品種是有效防治該病的手段之一[3-5]。常規(guī)雜交選育百合新品種是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，通常需要10年以上的時(shí)間，而采用體細(xì)胞無性系變異離體篩選技術(shù)，可加速抗性育種進(jìn)程。利用病原菌毒素或類似物質(zhì)作為選擇劑，已篩選出抗甜菜褐斑病[6]、抗油菜黑脛病[7]、抗煙草野火病[8]、抗水稻紋枯病[9]、抗玉米小斑病[10]、抗小麥赤霉病[11]、抗茄子黃萎病[12]、抗番茄晚疫病[13]、抗西瓜枯萎病[14]和抗香蕉枯萎病[15]等突變體，但還沒有關(guān)于百合等花卉的嘗試。筆者以百合為試驗(yàn)材料，附加不同濃度的鐮刀菌毒素粗提液進(jìn)行抗性突變體的篩選，以期獲得百合抗鐮刀菌的育種中間材料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為元帥（Acapulco）、卡薩布蘭卡（Casablanca）2個(gè)百合商業(yè)品種的愈傷組織。所用尖孢鐮刀菌百合轉(zhuǎn)化型（Fusarium oxysporumf. sp.lilii） lily-F菌株由農(nóng)業(yè)部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（昆明）提供。

主要儀器為日立S-3000N型掃描電鏡和美國(guó)貝克曼庫爾特公司的DU640型紫外分光光度計(jì)。

1.2 方 法

1.2.1 尖孢鐮刀菌粗毒素的制備

將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上的尖孢鐮刀菌落切成約5 mm×5 mm 的方塊，接種于裝有150 mL 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶3塊，置于控溫?fù)u床上，振蕩培養(yǎng)15 d。搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度25 ℃。待菌絲體長(zhǎng)出，且營(yíng)養(yǎng)液由混濁變?yōu)槌吻鍟r(shí)，用雙層紗布過濾掉菌絲和孢子，濾液300 r/min離心20 min后，去沉淀，上清液煮沸15 min，冷卻后，用細(xì)菌過濾器過濾滅菌，即得到無菌毒素粗提液[16]。

1.2.2 尖孢鐮刀菌毒素活力的測(cè)定

1） 用幼苗浸漬法測(cè)定：取Acapulco的愈傷組織再生組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，分別用體積分?jǐn)?shù)100%、80%、60%、40%、20%的毒素粗提液浸泡根部，放25 ℃光照培養(yǎng)箱，逐日觀察幼苗失水萎蔫情況。以無菌水浸泡為對(duì)照。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為健康無病；1級(jí)為1～2片葉片葉緣卷曲萎蔫；2級(jí)為3～4片葉片卷曲萎蔫；3級(jí)為5～6片葉片卷曲萎蔫；4級(jí)為葉片幾乎全部萎蔫，甚至死亡。

2） 用愈傷組織浸漬法測(cè)定：用毒素粗提液原液浸泡Casablanca的愈傷組織，分別在浸泡后24、48 h取樣，在掃描電鏡上觀察、拍照。以未用毒素原液處理的愈傷組織為對(duì)照。

1.2.3 抗病突變體的篩選

1） 篩選壓的確定。分別配制體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、75%的毒素粗提液。愈傷組織繼代培養(yǎng)基（經(jīng)前期試驗(yàn)確定）為MS+2 mg/L Picloram + 0.03 mg/L TDZ +500 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L酵母提取物。以不添加毒素的愈傷繼代培養(yǎng)基為對(duì)照。分別將Acapulco、Casablanca的愈傷組織接種到上述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d，觀察、統(tǒng)計(jì)愈傷組織的存活率。以存活率為10%～30%的毒素濃度為臨界致死濃度[17]。

2） 毒素粗提液的加壓篩選。采用一步選擇法，將上述試驗(yàn)中確定為臨界致死濃度的毒素粗提液附加到愈傷繼代培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基即為抗病篩選的選擇培養(yǎng)基。將Acapulco、Casablanca的愈傷組織接種于選擇培養(yǎng)基上，10 d后將存活的愈傷組織轉(zhuǎn)入未添加毒素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，如此反復(fù)篩選3次。將最終存活的愈傷組織轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基（經(jīng)前期試驗(yàn)確定）MS+1.0 mg/L BA +0.1 mg/L KT +0.1 mg/L IBA中誘導(dǎo)分化，30 d后統(tǒng)計(jì)分化率。

1.2.4 抗尖孢鐮刀菌無性系再生苗防御酶活性測(cè)定和抗病性鑒定

對(duì)Acapulco、Casablanca抗病愈傷組織再生苗人工接種百合枯萎病菌孢子懸浮液（孢子5×105個(gè)/mL），每處理5株，重復(fù)3次，每重復(fù)2株。以未經(jīng)篩選的再生百合組培苗為對(duì)照。分別在接種后0、12、24、36、48 h取樣，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定過氧化物酶（POD）[18]、超氧化物歧化酶（SOD）[19]、多酚氧化酶（PPO）[20]的活性。7 d后觀察篩選株的感病情況。病情分級(jí)與1.2.2分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)相同。病情指數(shù)=Σ（（病級(jí)植株數(shù)×病級(jí)代表數(shù)值）/（總植株數(shù)×最高病級(jí)代表數(shù)值））×100[21]。按樣本的病情指數(shù)劃分抗性等級(jí)：高抗≤20，中抗＞20～50，中感＞50～80，高感＞80。

醫(yī)院急危重癥患者較多，急救隊(duì)伍面臨的壓力也相對(duì)較大。急救時(shí)間和措施也關(guān)系著患者被救治成功率及愈后生活質(zhì)量。醫(yī)院對(duì)于急診科，從人員配備、設(shè)備配置、技術(shù)人員培養(yǎng)、職工績(jī)效等方面，都給予了政策上一定程度的傾斜。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2000和SPSS 13.0分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌毒素粗提液的活性和篩選壓

2.1.1 尖孢鐮刀菌毒素粗提液的活性

百合幼苗經(jīng)尖孢鐮刀菌毒素粗提液處理后，葉片逐漸萎蔫致死。從表1可以看出，毒素體積分?jǐn)?shù)100%時(shí)，2 d后幼苗開始萎蔫，5 d后死亡；毒素體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)，3 d后幼苗葉片輕度萎蔫。可見毒素濃度越高，幼苗萎蔫越快，程度越重；毒素體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)，4 d幼苗葉片只有輕度萎蔫。

經(jīng)毒素處理的Casablanca愈傷組織細(xì)胞的電鏡掃描結(jié)果（圖1）表明，鐮刀菌毒素對(duì)愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生毒害，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，毒害加重：未經(jīng)毒素處理的愈傷組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞內(nèi)含物豐富；處理24 h后，愈傷組織細(xì)胞出現(xiàn)破裂和塌陷現(xiàn)象；處理48 h后，愈傷組織細(xì)胞所受毒害加重，出現(xiàn)蜂窩狀大面積塌陷，細(xì)胞解體。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)尖孢鐮刀菌粗毒素對(duì)百合再生苗的影響Table 1 Effects of Fusarium toxin concentration on plantlet regeneration of lily

圖1 卡薩布蘭卡愈傷組織細(xì)胞的電鏡掃描結(jié)果Fig.1 Scanning electron micrographs on callus of Casablanca

“－” 無反應(yīng)，植株正常；“+” 輕度反應(yīng)，1～2片葉片葉緣卷曲萎蔫；“++”中度反應(yīng)，大部分葉片卷曲萎蔫；“+++”重度反應(yīng)，全部葉片卷曲萎蔫；“++++”全部死亡。

幼苗浸漬法和愈傷組織浸漬法對(duì)鐮刀菌毒素活力的測(cè)定結(jié)果表明，無論在細(xì)胞水平，還是在植株水平，鐮刀菌毒素都對(duì)百合產(chǎn)生毒害，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，毒害加重，說明在發(fā)酵培養(yǎng)過程中鐮刀菌毒素已充分釋放到培養(yǎng)原液中，用此原液作為選擇劑，對(duì)抗鐮刀菌無性系進(jìn)行篩選是可行的。

由表2可看出，毒素對(duì)2個(gè)品種愈傷組織的生長(zhǎng)均表現(xiàn)抑制作用。隨著毒素體積分?jǐn)?shù)的增大，愈傷組織存活率降低，抑制效果愈明顯。75%毒素粗提液下，2個(gè)品種愈傷組織的存活率分別為20%和25%.

表2 不同體積分?jǐn)?shù)尖孢鐮刀菌粗毒素對(duì)百合愈傷組織生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different concentrations of Fusarium toxin on lily callus

從愈傷組織表現(xiàn)狀態(tài)上看，10 d時(shí)，75%毒素粗提液處理的愈傷組織松散，褐化死亡，只有極少數(shù)存活，因此，75%毒素體積分?jǐn)?shù)處理10 d可視為大部分細(xì)胞生長(zhǎng)的1個(gè)拐點(diǎn)，在抗尖孢鐮刀菌無性系篩選試驗(yàn)中，75%毒素體積分?jǐn)?shù)就是臨界致死濃度，可使用含此濃度毒素的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基。

2.2 抗尖孢鐮刀菌無性系的獲得

經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的尖孢鐮刀菌粗毒素篩選后，240塊Acapulco愈傷組織有28塊存活，存活率為11.67%，其中又有 10塊分化出了不定芽，分化率為35.71%，突變率為4.17%；240塊Casablanca愈傷組織有47塊存活，存活率為19.58%，其中有14塊分化出了不定芽，分化率為 29.79%，突變率為5.83%。Casablanca的存活率和分化率都比Acapulco高。以上結(jié)果表明，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的毒素處理過的細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生突變，并且部分抗鐮刀菌毒素的突變基因得到表達(dá)，從而使愈傷組織能在鐮刀菌毒素的臨界致死濃度下生存下來。

2.3 抗尖孢鐮刀菌無性系人工接種的抗病性

與對(duì)照株相比，Acapulco和Casablanca抗尖孢鐮刀菌無性系人工接種鐮刀菌孢子懸浮液后7 d，其植株正常生長(zhǎng)，對(duì)枯萎病表現(xiàn)出一定的抗性?？剐澡b定結(jié)果（表4）表明，Acapulco和Casablanca的抗病突變株均達(dá)到中抗水平。

表3 抗尖孢鐮刀菌無性系人工接種對(duì)枯萎病的抗性Table 3 The evaluation of lily plantlets regenerated for resistance to Fusarium wilt

2.4 抗尖孢鐮刀菌無性系人工接種后的防御酶活性

從圖2和圖3可以看出，經(jīng)孢子懸浮液接種后，2品種抗尖孢鐮刀菌無性系的POD、PPO活性均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。2品種抗尖孢鐮刀菌無性系的 POD、PPO活性比其對(duì)照株均有所提高，Acapulco抗尖孢鐮刀菌無性系的POD變化明顯，峰值比對(duì)照株提高了106.54 U/（g·min）；其PPO活性比對(duì)照株也有明顯增長(zhǎng)。Casablanca抗尖孢鐮刀菌無性系的POD活性變化幅度比Acapulco抗尖孢鐮刀菌無性系小，但峰值比對(duì)照株也提高了 20.13 U/（g·min）；在整個(gè)測(cè)試過程中，抗尖孢鐮刀菌無性系PPO活性的變化明顯，但其對(duì)照的變化不大。

圖2 人工接種枯萎病菌后不同時(shí)間再生百合苗葉片的POD活性Fig.2 POD activity of leaves of lily regeneration plants at different time after inoculation of Fusarium

圖3 人工接種枯萎病菌后不同時(shí)間再生百合苗葉片的PPO活性Fig.3 PPO activity of leaves of lily regeneration plants at different time after inoculation of Fusarium

從圖4可以看出，接種孢子懸浮液后，2品種抗尖孢鐮刀菌無性系的SOD活性升高，但Casablanca對(duì)照株的SOD活性在36 h后下降。2品種抗尖孢鐮刀菌無性系SOD活性比其對(duì)照株均有提高。SOD活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說明經(jīng)孢子懸浮液處理后百合植株清除氧自由基的能力增強(qiáng)。

圖4 人工接種枯萎病菌后不同時(shí)間再生百合苗葉片的SOD活性Fig.4 SOD activity of leaves of lily regeneration plants different time after inoculation Fusarium

3 結(jié)論與討論

a. 采用一步選擇法，將百合愈傷組織接種在含臨界致死濃度鐮刀菌毒素粗提液的培養(yǎng)基上，反復(fù)篩選最終得到了抗尖孢鐮刀菌無性系植株。利用真菌毒素作為選擇劑，必須注意適宜的篩選濃度和篩選周期，同時(shí)在起始篩選時(shí)，必須有較大的供選群體。采用適宜毒素濃度是抗病篩選的關(guān)鍵，濃度過高，不易得到數(shù)量較多的愈傷組織或細(xì)胞；濃度過低，不易篩選出抗性材料。

b.用鐮刀菌孢子懸浮液接種百合抗尖孢鐮刀菌無性系植株之后，Acapulco和Casablanca的對(duì)照株與抗尖孢鐮刀菌無性系植株葉片內(nèi)的SOD、POD、PPO活性均先升高后降低，但抗尖孢鐮刀菌無性系植株的變化更為明顯，酶活性保持較高水平，可見，SOD、POD、PPO活性可以作為初步鑒定抗性突變體的指標(biāo)。

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英文編輯：羅文翠