大鼠亞慢性鎘中毒模型的建立*

劉 霞,楊 艷,楊鵬輝,陳紅霞,仝 雷,張齊好,蘇志堅(jiān),2,黃亞?wèn)|*

(1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心,廣東廣州510632;2.暨南大學(xué) 廣東省生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510632)

鎘(cadmium,Cd)是一種有色重金屬元素,可以對(duì)人和動(dòng)物多種器官[1-4]產(chǎn)生毒害作用,是常見的環(huán)境和工業(yè)污染物之一。由于鎘具有不可降解性和極長(zhǎng)的半衰期,因此,微量的鎘進(jìn)入機(jī)體即可通過(guò)生物放大和積累,對(duì)腎、肝、肺、骨、生殖和免疫等器官系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷。鎘污染對(duì)動(dòng)物健康己經(jīng)構(gòu)成了巨大的潛在性威脅[5],美國(guó)毒物管理委員會(huì)(ATSDR)已將其列為第6位危及人類健康的有毒物質(zhì)。近幾年來(lái),鎘污染對(duì)雄性動(dòng)物[6]和人類生殖功能的潛在危害作用越來(lái)越為科學(xué)家所重視。研究發(fā)現(xiàn),鎘中毒可以引起家畜尤其是雄性家畜繁殖功能下降,人類男性“勃起功能障礙”(erectile dysfunction,ED)也可能與鎘暴露有關(guān)[7-8]。本試驗(yàn)通過(guò)灌胃的方式,研究不同濃度鎘對(duì)雄性大鼠肝、腎生理指標(biāo)的影響及組織病理學(xué)改變,旨在更好地模擬鎘對(duì)機(jī)體的亞慢性污染,為深入研究與防治亞慢性鎘中毒提供較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 氯化鎘(CdCl2°2.5H2O) 分析純,天津科密歐試劑,批號(hào)61504;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純和分析純。

1.1.2 儀器 IL-551型原子吸收分光光度計(jì),O-lympus顯微照相系統(tǒng),推拉式三用切片機(jī),電熱恒溫干燥箱,電子天平(0.000 1 g),大鼠彎頭灌胃針,島津AA-6300型石墨爐原子吸收分光光度計(jì),日立7180型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及染毒 140 g～160 g SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂飼7 d后,隨機(jī)分為5組并分別命名為A、B、C、D、E組,每組6只。A為對(duì)照組,用去離子水灌胃。模型組B、C、D、E組大鼠,用濃度為1.25、2.5、5、10 mg/kg的CdCl2溶液灌胃,每周一至周五灌胃,周末2 d正常飼養(yǎng),試驗(yàn)周期為8周,共計(jì)56 d。各組大鼠均以普通飼料飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),自由飲水,每隔1 d稱重。動(dòng)物房溫度17℃～23℃,相對(duì)濕度45%～55%。

1.2.3 樣品采集及處理 取血樣前大鼠禁食1 d,每隔兩周尾靜脈取血1次,檢測(cè)血清中尿素、肌酐含量和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸脫氫酶活力。第8周尾靜脈取血后將大鼠斷頸處死,解剖切取肝、腎組織,于40 mg/L多聚甲醛溶液中固定備用。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 大鼠體重從試驗(yàn)開始起,隔天稱量,收集數(shù)據(jù)。采用日立全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中尿素和肌酐含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶活力。于試驗(yàn)第56天,采用石墨子原子吸收光譜法[9]測(cè)定血液和肝、腎中鎘的含量。肝腎組織病理形態(tài)學(xué)檢查為常規(guī)病理樣品處理制片,HE染色鏡檢。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,結(jié)果以_X±S的形式表示,不同處理組間差異顯著性檢驗(yàn)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 鎘對(duì)大鼠體重的影響

不同染鎘劑量及染鎘時(shí)間對(duì)大鼠體重的影響見表1。

各染鎘組大鼠體重增長(zhǎng)與正常組基本保持一致,隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì),與染鎘劑量和時(shí)間無(wú)依賴性關(guān)系(表1)。

表1 不同染鎘劑量及染鎘時(shí)間對(duì)大鼠體重的影響Table 1 Effects of different CdCl2dosages on weight of ratsg

2.2 鎘對(duì)大鼠肝功能的影響

在染毒56 d后,C、D、E組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力顯著升高,而乳酸脫氫酶活性與對(duì)照組相比較無(wú)顯著差異(表2,表3)。

表2 不同時(shí)期各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性Table 2 AL T activity in the serum of rats at different treatment timeU/L

表3 不同時(shí)期各組大鼠血清乳酸脫氫酶活性T able 3 LDH activity in the serum of rats at different treatment-timeU/L

2.3 鎘對(duì)大鼠腎功能的影響

鎘對(duì)大鼠腎功能的影響主要通過(guò)測(cè)定血清中尿素(BUN)、肌酐(Cr)的含量來(lái)進(jìn)行評(píng)估(表4和表5)。灌胃處理28 d后,E組大鼠血清中尿素含量與對(duì)照組相比有顯著差異。而隨著染鎘時(shí)間的延長(zhǎng),42 d和56 d,D和C組大鼠血液中的尿素亦逐漸上升,與對(duì)照組相比,也有顯著差異。血尿素濃度與大鼠染鎘劑量及時(shí)間呈線性依賴關(guān)系,但血液中的肌酐含量在整個(gè)鎘處理的過(guò)程無(wú)顯著性變化。

表4 不同時(shí)期各組大鼠血清中尿素濃度T able 4 BUN concentration in the serum of rats at different treatment timemmol/L

表5 不同時(shí)期各組大鼠血清中肌酐濃度Table 5 Cr concentration in serum of rats at different treatment timeμ mol/L

2.4 不同濃度氯化鎘處理后血液中鎘的蓄積量

大鼠處理56 d后氯化鎘在血液中的蓄積量與氯化鎘的濃度呈正相關(guān),即隨著灌服氯化鎘濃度的增大,血液中蓄積的鎘離子增多(圖1)。

圖1 不同濃度氯化鎘處理后血液中鎘濃度的變化Fig.1 Cadmium concentration in serum of rats with different CdCl2treatment

2.5 不同濃度氯化鎘處理后肝腎組織中鎘的蓄積量

對(duì)照組大鼠腎中未檢測(cè)到鎘的蓄積,肝中有極少量的鎘。試驗(yàn)組肝鎘和腎鎘的濃度隨著染鎘濃度的增加而增加,其中肝對(duì)鎘的蓄積能力高于腎(圖2)。

圖2 不同濃度氯化鎘處理后肝腎中鎘濃度的變化Fig.2 Cadmium concentration in the liver and kidney of rats with different CdCl2treatment

2.6 染鎘后大鼠肝腎組織學(xué)變化

各組大鼠染鎘56 d后,腎臟外觀呈不同程度腫大,腎小管擴(kuò)張,部分腎小管萎縮,腎近曲小管上皮細(xì)胞渾濁。當(dāng)大鼠染CaCl2°2.5H2O劑量每天大于5 mg/kg時(shí),腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管有水樣變性,管腔增大,間質(zhì)水腫,部分細(xì)胞壞死脫落。在D和E組大鼠的腎組織中,在光學(xué)顯微鏡下觀察到腎小管發(fā)生細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象(圖3)。

染鎘大鼠肝臟外觀顏色變暗,最高劑量組E組大鼠的肝臟接近暗黑色。當(dāng)染CaCl2°2.5H2O劑量每天高于5 mg/kg時(shí),肝細(xì)胞呈現(xiàn)疏松腫脹,部分變性。肝小梁擁擠,排列受破壞,肝竇受壓變窄,中央靜脈大量充血(圖4)。相同染鎘劑量下,病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠的腎損傷比肝損傷更為明顯。

圖3 不同劑量染鎘大鼠腎組織HE染色(400×,F200×)Fig.3 Pathohistological sections of kidney tissues in rats of different CdCl2treatment

圖4 不同劑量染鎘大鼠肝組織HE染色(200×,F400×)Fig.4 Pathohistological sections of liver tissues in rats with treatment of defferent concentration of CdCl2

3 討論

重金屬污染已成為社會(huì)十分關(guān)注的問(wèn)題,它對(duì)人體造成危害的主要途徑是隨著各種食物和水進(jìn)入人體。一般來(lái)說(shuō),重金屬污染常以慢性中毒的方式危害人類。而鎘是一種常見的可通過(guò)接觸、呼吸道、消化道等途徑進(jìn)入人體的有毒重金屬,且其對(duì)人體肝、腎臟器的損傷較為明顯。目前關(guān)于鎘中毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的研究,主要包括:使用外科手術(shù)損傷肝、腎[10-11],CdCl2或鎘金屬硫蛋白復(fù)合物(Cd-M T)腹腔注射[12],飲食含鎘的水或食物[13]等。鎘在肝、腎臟器內(nèi)蓄積和產(chǎn)生毒作用均為一緩慢過(guò)程,急性CdMT注射或是外致?lián)p傷建立的模型[14-21]不適合研究慢性鎘中毒對(duì)肝腎損傷的機(jī)制。本研究采用灌胃方式,制備不同濃度鎘亞慢性大鼠中毒模型。此方法與自然條件下的鎘中毒比較相似,為鎘中毒的防治研究提供了可靠的基礎(chǔ),同時(shí)也為研究亞慢性鎘中毒對(duì)大鼠肝腎損傷的機(jī)制提供依據(jù)。

染鎘劑量對(duì)雄性Wistar大鼠的體重?zé)o顯著性影響。生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),染鎘組大鼠均有不同程度的肝腎功能損害,損傷情況均隨著染鎘時(shí)間和染鎘劑量的增加而加重。其中大鼠血清LDH活力及肌酐含量在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有顯著性改變,但血清中的ALT酶活力和尿素含量與大鼠染鎘劑量及時(shí)間呈線性依賴關(guān)系。當(dāng)染CaCl2°2.5H2O劑量每天為2.5 mg/kg、染鎘時(shí)間為56 d及染CaCl2°2.5H2O劑量為每天10 mg/kg、染鎘時(shí)間為28 d時(shí),血清中的尿素含量相比于對(duì)照組呈顯著性差異。而血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性只有在染鎘時(shí)間達(dá)到56 d時(shí),各模型組大鼠才呈現(xiàn)差異。這些結(jié)果說(shuō)明,相同染鎘條件下鎘對(duì)大鼠的腎損傷較肝更為明顯。血液、肝臟、腎鎘含量測(cè)定結(jié)果則表明,肝臟在染毒過(guò)程中有較強(qiáng)的鎘結(jié)合能力,使肝臟鎘含量呈線性快速增加。盡管肝對(duì)鎘的蓄積能力高于腎,但腎也是重金屬鎘的重要貯存器官和主要排泄器官,因此鎘作用于機(jī)體易表現(xiàn)出腎臟功能或形態(tài)的損傷。大鼠肝腎病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果同樣證明了相同染鎘條件下,大鼠的腎損傷更為明顯。

本試驗(yàn)中每天灌胃鎘水劑量大于5 mg/kg且灌胃時(shí)間超過(guò)42 d而建立的動(dòng)物模型可以很好地作為模擬鎘慢性中毒機(jī)制的動(dòng)物模型,為研究亞慢性鎘中毒對(duì)大鼠肝腎的損傷機(jī)制提供理論依據(jù)。

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