雞源沙門菌的耐藥性及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究

董劍輝,熊惠軍,宋 立,陳 瑞

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

沙門菌(Salmonella)是一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無(wú)芽胞直桿菌,由其感染引發(fā)的沙門菌病是一種重要的人獸共患病[1],其中許多血清型菌能在人和動(dòng)物之間交叉感染,對(duì)人類、畜禽飼養(yǎng)業(yè)造成巨大危害,因此,預(yù)防和治療沙門菌感染顯得尤為重要[2]?？股卦诜乐涡笄菁膊≈衅鹬匾饔?但隨著抗菌藥在畜牧業(yè)上的廣泛使用,細(xì)菌的耐藥性不斷加劇和蔓延,因此帶來(lái)的耐藥問(wèn)題、食品安全問(wèn)題及公共衛(wèi)生問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重,已引起了全球的關(guān)注[3-4]。加強(qiáng)沙門菌耐藥性的研究,對(duì)預(yù)防和控制沙門菌病的流行具有重要意義。目前,傳統(tǒng)的血清分型方法已經(jīng)不能滿足要求,需要采用分型能力更強(qiáng)的分子分型方法進(jìn)一步分析不同來(lái)源的沙門菌之間的聯(lián)系。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型方法為目前國(guó)際上分子分型的通用方法[5-6]。

本試驗(yàn)對(duì)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測(cè)技術(shù)研究室2009年在北京地區(qū)所采集的病料進(jìn)行分離鑒定。并用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Iaboratory Standards Institute,CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定,采用PFGE方法對(duì)分離菌株進(jìn)行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2009年4月從北京地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)采集的泄殖腔拭子、肝臟、卵黃囊。質(zhì)控菌株ATCC25922由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測(cè)技術(shù)研究室提供。PFGE相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用沙門菌Braenderup血清型全球參考菌株H9812。

1.1.2 主要試劑及儀器 麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MH肉湯均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供;抗菌藥藥敏板購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司;限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購(gòu)自Promega公司;PFGE專用瓊脂糖Seakem Gold購(gòu)自Rockland公司;蛋白酶K購(gòu)自Merck公司;API ID 32E試紙條、ATB細(xì)菌鑒定儀均購(gòu)自法國(guó)bioMerieux公司;Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定儀購(gòu)自美國(guó)Du Pont公司;脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為Bio-Rad公司CHEF-DRⅢ型。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 將所采集樣品接種于3 mL～5 mL滅菌四硫磺酸鹽增菌液中,42℃培養(yǎng)24 h;用接種環(huán)挑取新鮮培養(yǎng)的增菌液,沙門菌顯色培養(yǎng)基上劃線,37℃恒溫培養(yǎng)16 h～18 h;挑取紫色單菌落,接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂,37℃恒溫培養(yǎng)16 h～18 h。

1.2.2 細(xì)菌的鑒定 按照API ID 32E試紙條操作步驟將分離到的細(xì)菌接種到試紙條上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,用ATB細(xì)菌鑒定儀鑒定分離到細(xì)菌的種類。用Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定儀鑒定其血清型。

1.2.3 耐藥性測(cè)定 用藥敏板進(jìn)行檢測(cè),試驗(yàn)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI所推薦的微量肉湯稀釋法。用ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

1.2.4.1 細(xì)菌處理 將分離的沙門菌及標(biāo)準(zhǔn)株H9812復(fù)蘇。用滅菌棉簽取適量細(xì)菌,懸浮于1 mL CSB溶液中,用紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液的OD620nm值至1.5～1.6。

1.2.4.2 制備膠塊 取200 μ L細(xì)菌懸浮液于2 mL離心管中,置于37℃水浴中孵育5 min。每管加入5 μ L濃度為20 mg/mL蛋白酶K。并加入200 μ L已融化并在56℃水浴平衡的10 g/L的Seakem Gold瓊脂糖溶液(含10 mL/L SDS),用移液器加入膠塊制備模具。

1.2.4.3 細(xì)菌裂解 在50 mL的離心管中加入5 mL的細(xì)胞懸浮緩沖液CLB,然后再加入25 μ L的濃度為20 mg/mL蛋白酶K,從模具中取出細(xì)菌包埋膠塊放入到離心管中,54℃搖床中孵育6 h,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.4.4 洗滌膠塊 倒掉混合液,加入15 mL 50℃預(yù)熱的去離子水。50℃搖床洗滌10 min,洗滌2次。用50℃預(yù)熱的TE buffer同樣條件洗滌4次。

1.2.4.5 XbaⅠ酶切 在2 mL離心管中加入200 μ L膠塊平衡液,將洗滌過(guò)的膠塊切成2 mm寬的膠條,放入膠塊平衡液中,37℃孵育10 min,棄平衡液,加入200 μ L酶切溶液(175 μ L去離子水:20 μ L buffer:5 μ L XbaⅠ酶),37℃孵育12 h,棄酶切液。加入200 μ L 0.5×TBE電泳緩沖液平衡5 min。

1.2.4.6 加樣 取出膠塊,第1、7、15齒各加1個(gè)H9812菌膠塊作為Marker,其余各齒依次加樣品。將梳子放入膠槽,緩慢倒入100 mL熔化后并在60℃水浴平衡的10 g/L Seakem Gold瓊脂糖溶液。

1.2.4.7 電泳 加2 200 mL 0.5×TBE電泳緩沖液,電泳時(shí)間19 h,電泳溫度為14℃。

1.2.4.8 染色 電泳后將膠放入含0.5 μ g/mL EB的染液中染色30 min,然后用去離子水脫色1 h。1.2.4.9 成像及分析 用凝膠成像儀成像,并用Info Quest FP聚類分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

本次試驗(yàn)從所采集樣品中共分離出16株沙門菌。其中,腸炎沙門菌15株,分別從泄殖腔拭子、肝臟、卵黃囊中各分離出3株、7株、5株;鼠傷寒沙門菌1株,分離于卵黃囊。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由以下23種被測(cè)藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果和耐藥譜(表1和表2)可以看出,16株雞源沙門菌對(duì)獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物耐藥率較高,利福平為100.00%,萘啶酸為100.00%,多黏菌素E為88.24%;對(duì)阿米卡星、大觀霉素、氟苯尼考、安普霉素等均敏感。受試菌對(duì)被測(cè)藥物的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果T able 1 The result of antimicrobial sensitivity test

表2 16株雞源沙門菌的耐藥譜T able 2 Drug-resistant spectrium of 16 Salmonella gallinarum strains

2.3 PFGE結(jié)果

16株沙門菌經(jīng)XbaⅠ酶切,PFGE后,每個(gè)菌株產(chǎn)生10條～15條電泳條帶,大小在20 kb～1 200 kb之間,部分菌株的PFGE結(jié)果(圖1)。

圖1 部分沙門菌PFGE圖譜Fig.1 Representative PFGE patterns of 12Salmonellastrains

2.4 聚類分析結(jié)果

用Info Quest FP聚類分析軟件分析15株腸炎沙門菌PFGE圖譜(圖2)顯示,其相似度在87.6%～100%之間,共分為A型和B型兩個(gè)帶型,其中A型共有14株,B型僅有1株,A型為優(yōu)勢(shì)帶型(占總數(shù)的93.33%)。

圖2 15株腸炎沙門菌的聚類分析圖Fig.2 The cluster analysis figure of 15 S.enteritidis strains

3 討論

沙門菌是一種常見的人獸共患病病原菌,不僅能導(dǎo)致雞白痢、禽傷寒和禽類副傷寒等疾病,而且也能引起人類傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎等疾病。進(jìn)行沙門菌耐藥性的監(jiān)測(cè)不僅可指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)防禽類重大沙門菌病的流行,而且在公共衛(wèi)生方面也有重要的意義[7-8]。

本試驗(yàn)對(duì)分離出的16株沙門菌進(jìn)行血清型鑒定,結(jié)果表明有腸炎沙門菌15株(93.75%),鼠傷寒沙門菌1株(6.25%),優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門菌,與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。在16株受試菌中,多重耐藥菌株數(shù)為16株,占受試菌的100%,說(shuō)明此次分離的腸炎沙門菌耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。耐藥率較高的藥物為利福平、萘定酸、多黏菌素E,在88.24%～100%之間,可能與這3種藥物問(wèn)世早,臨床應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。受試菌對(duì)阿米卡星、大觀霉素、安普霉素非常敏感,在治療北京地區(qū)的腸炎沙門菌感染時(shí)可作為首選藥物。腸炎沙門菌對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢唑林、頭孢噻呋及頭孢曲松的耐藥率均為6.25%,表明氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物對(duì)腸炎沙門菌也具有較好的抗菌活性。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物對(duì)腸炎沙門菌的抗菌效果相當(dāng),可用這兩類藥物作為治療該地區(qū)腸炎沙門菌感染的首選藥物,但由于頭孢類抗生素價(jià)格昂貴,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,在治療腸炎沙門菌感染時(shí),選用氟喹諾酮類藥物更為合理。

沙門菌傳統(tǒng)的分型方法只能從血清型、噬菌體、耐藥譜分型上去區(qū)分,這些分型都是從細(xì)菌的表型上進(jìn)行分型[11]。由于微生物易受環(huán)境的影響,很容易改變其表達(dá)性狀,使得表型分類很不準(zhǔn)確[12-13]。PFGE技術(shù)是基于DNA結(jié)構(gòu)的分子分型方法,被認(rèn)為是進(jìn)行分子分型的可信方法,在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于菌種的分子流行病學(xué)研究[14-16]。本試驗(yàn)用PFGE技術(shù)將腸炎沙門菌分型,試驗(yàn)結(jié)果表明北京地區(qū)的腸炎沙門菌分為A、B兩個(gè)型,其中A型為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型,而且同源性較高。同一血清型之間的PFGE圖譜也有一定的差異,說(shuō)明PFGE分型比傳統(tǒng)的血清型分型更加精細(xì),能在分子水平上對(duì)其分型。雖然PFGE基因分型技術(shù)比傳統(tǒng)的表型分型方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,但是其在調(diào)查細(xì)菌親緣關(guān)系方面比后者更有優(yōu)勢(shì)。PFGE技術(shù)在今后可能會(huì)更廣泛地運(yùn)用于分子分型和流行病學(xué)研究,并在追蹤傳染源和傳播途徑中發(fā)揮重要作用。

[1] 陳 瑞,熊惠軍,王培園,等.沙門菌腸毒素基因克隆及序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(9):25-28.

[2] Francois X W,Francoise G.Multidrug resistance in Salmonella enterica serotype typhimurium from humans in France[J].J Clin Microbiol,2006,44(3):700-708.

[3] 耿光瑞,趙月平,李寸欣,等.抗菌藥物的合理應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(8):97-100.

[4] Yang H,Chen S,White D G,et al.Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China[J].J Clin Microbiol,2004,42(8):3483-3489.

[5] Pang J C,Chiu T H,Helmuth R,et al.A pulsed field gel electropho resis(PFGE)study that suggests a major world-wide clone of Salmonella enterica serovar enteritidis[J].Int J Food Microbiol,2007,116(3):305-312.

[6] 聶小想,沈志強(qiáng),崔言順,等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)在豬鏈菌分型中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(1):70-73.

[7] 譚海芳,譚翰清,丁麗娜,等.食物中毒沙門菌PFGE分子分型及耐藥性研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(9):2039-2041.

[8] Kim S H,Kim S,Chun S G,et al.Phage types and pulsedfield gel electrophoresis patterns of Salmonella enterica serovar enteritidis isolated from humans and chickens[J].J Microbiol,2008,46(2):209-213.

[9] 石曉路,劉小立,黃 薇,等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳在沙門菌食物中毒溯源中的應(yīng)用研究[J].疾病控制雜志,2007,11(5):502.

[10] 馬 越,陳鴻波,李景云,等.1998-2000年沙門菌屬耐藥性變遷[J].中國(guó)抗感染化療雜志,2002,2(2):84-86.

[11] 陳 瑞,熊惠軍,宋 立,等.雞沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(11):846-849.

[12] 侯鳳伶,劉維華,申志新,等.沙門菌脈沖凝膠電泳分型研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(5):780-782.

[13] Kubota K,Barrett T J,Ackers M L,et al.Analysis of Salmonella enterica serotype typhi pulsed-field gel electrophoresis patterns associated with international travel[J].J Clin Microbiol,2005,43(3):1205-1209.

[14] 丁水軍,陳棋炯,孫永祥,等.食物中毒腸炎沙門菌的生物學(xué)特性及分子分型研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(6):1326-1328.

[15] 李孝權(quán),龐杏林,鄧志愛,等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳在腸炎沙門菌食源性疾病溯源中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(3):245-248.

[16] 徐景野,許國(guó)章,金春光,等.傷寒和甲型副傷寒沙門菌PFGE分型方法研究與應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn),2009,19(8):1738-1740.