阿德福韋聯(lián)合特異性樹突細(xì)胞疫苗治療慢性乙型肝炎抗病毒療效與Th細(xì)胞因子觀察

郭力紅 張歲 劉靜 李保欣 段衛(wèi) 佟立新

慢性乙型肝炎(CHB)由于病毒持續(xù)復(fù)制及免疫功能紊亂使肝細(xì)胞不斷受損害，最終發(fā)展為肝硬化或肝癌。阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)脫氧腺苷三磷酸底物，使乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)鏈終止而抑制病毒的復(fù)制［1］。CHB患者體內(nèi)乙型肝炎病毒(HBV)持續(xù)存在不易清除的原因可能是機(jī)體免疫力低下，對(duì)感染的HBV形成免疫耐受所致［2］。患者免疫功能缺陷的重要原因之一是其外周血中樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)數(shù)量下降，表型不成熟，功能降低，無(wú)法有效呈遞HBV抗原肽，不能誘發(fā)有效的特異的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而不能激活DC的抗原呈遞功能及IFN等Th1型因子的分泌，導(dǎo)致CHB患者Th1/Th2細(xì)胞間的失衡［3］。樹突狀細(xì)胞作為最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，是體內(nèi)唯一具有激活幼稚T淋巴細(xì)胞(native T lymphocyte)誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答能力的APC，Th1/Th2的平衡在HBV感染人體后病情發(fā)展方向中起到?jīng)Q定作用，Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生白介素2(IL-2)、IFN-γ等細(xì)胞因子，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，故觀察血清IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子，研究HBV感染時(shí)Th1/Th2狀態(tài)對(duì)認(rèn)識(shí)乙型肝炎發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后和觀察治療效果均有積極意義。本文通過(guò)觀察CHB患者在應(yīng)用ADV聯(lián)合特異性樹突細(xì)胞疫苗治療過(guò)程中，分析治療后抗病毒療效及Th細(xì)胞因子的變化，為聯(lián)合治療慢性乙肝提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年10月至2009年10月我肝病中心門診或住院慢性乙型肝炎患者32例，男28例，女4例;年齡18～64歲，平均年齡(36±11)歲。所有患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)均＞40 U/L，HBV-DNA均＞5.03log10。入選患者無(wú)其他病毒合并感染及嚴(yán)重并發(fā)癥，治療前6個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何抗病毒及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的藥物，全部獲得知情同意。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年修訂的“病毒性肝炎防治方案”［4］及2005年“慢性乙型肝炎防治指南”。

1.2 主要試劑與儀器 DC疫苗制備試劑:重組人粒-巨嗜細(xì)胞集落細(xì)胞刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素-4(rhIL-4)、1640培養(yǎng)液、鼠抗人CD40、CD83，購(gòu)于河北博海生物工程有限公司，HBsAg購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑:IL-4、IFN-γ抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于河北生物工程有限公司。儀器:二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，可在450 nm處進(jìn)行計(jì)數(shù)的全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo，芬蘭)，37℃恒溫箱(SBHW-IV，北京)，可調(diào)多道移液器及槍頭(EPPENDORF，德國(guó))，離心機(jī)(LD-25-2，北京)，振蕩混勻器(XW-80A，上海)。

1.3 方法 在無(wú)菌條件下抽取受試者外周靜脈血20 m l，肝素抗凝，在百級(jí)試驗(yàn)室進(jìn)行下面操作:0.9%氯化鈉溶液1∶1稀釋抗凝血，層加到淋巴細(xì)胞分離液2 000 r/min離心30 min，分離出外周血單核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用1640培養(yǎng)液洗2次，在加入含有體積分?jǐn)?shù)150 ml人AB型血清的1640培養(yǎng)液完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×109/L的細(xì)胞濃度加入一次性6孔培養(yǎng)板中，于37℃ 50 ml/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，再用1640培養(yǎng)液輕洗2次，除去非貼壁細(xì)胞，加入含8 335μkat/L rhGMCSF和8 335μkat/L rhIL-4的完全培養(yǎng)基，隔日換液，培養(yǎng)至第6天再加入終濃度為2.5 mg/L的HBsAg，4 h后加入終濃度為10μg/L的 TNF，繼續(xù)在37℃ 50 ml/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)1 d，收獲DC用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次并計(jì)數(shù)，即刻在受試者腋下部位常規(guī)消毒后經(jīng)皮下注入體內(nèi)。同時(shí)取細(xì)胞洗液做無(wú)菌實(shí)驗(yàn)?；剌?次為1個(gè)療程(間隔周)，共治療3個(gè)療程。1.4 檢測(cè)指標(biāo) 留取患者治療前及治療過(guò)程中的血清，凍存于-86℃冰箱，分別檢測(cè)治療前及治療過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性乙肝患者肝功能、HBV-DNA在治療過(guò)程中的變化ALT和AST從治療4周末有明顯改善(P＜0.05)，AST到12周末達(dá)正常范圍，ALT到48周末達(dá)正常范圍。HBV-DNA從治療12周末起即有明顯改善(P＜0.05)，在治療12周末、24周末改善值明顯升高(P＜0.05)，在48周末病毒陰轉(zhuǎn)。見表1。

2.2 IFN-γ、IL-4在治療過(guò)程中的變化 IFN-γ水平在12周末、24周末明顯高于治療前(P＜0.05)，IL-4水平在12周末、24周末明顯低于治療前(P＜0.05)。見表2。

表1 治療前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA變化n=32，±s

表1 治療前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA變化n=32，±s

注:與治療前比較，*P＜0.05

指標(biāo) 治療前 治療4周 治療12周 治療24周 治療48周ALT(U/L) 132±48 70±25* 48±15* 46±16* 35±10*AST(U/L) 85±23 70±25* 31±9* 28±7* 29±8*DNA(log10) 6.4±0.8 5.8±0.8 4.9±0.9* 3.9±0.7* 2.8±0.8*

表2 IFN-γ、IL-4在治療前及治療過(guò)程中的變化n=32，±s

表2 IFN-γ、IL-4在治療前及治療過(guò)程中的變化n=32，±s

注:與治療前比較，*P＜0.05

指標(biāo) 治療前 治療4周 治療12周 治療24周 治療48周IFN-γ 39±9 39±9 55±12* 58±12*39±8 IL-4 371±45 377±50 287±48* 282±55*371±47

3 討論

慢性乙型肝炎是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的常見傳染病，全球有約4億人患CHB［5］，約30%的肝硬化和50%的肝細(xì)胞癌發(fā)病與之有關(guān)［6］，給個(gè)人、家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)CHB治療已有較大的進(jìn)展，其中抗病毒治療是最主要、最根本的措施［7］。

阿德福韋酯口服后經(jīng)過(guò)體內(nèi)非特異性酯酶水解，迅速轉(zhuǎn)化為阿德福韋，阿德福韋是一種無(wú)環(huán)單磷酸脫氧腺苷類似物，被細(xì)胞內(nèi)普遍存在的激酶磷酸化生產(chǎn)二磷酸阿德福韋。二磷酸阿德福韋和脫氧腺苷三磷酸(dATP)與多聚酶結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制HBV-DNA，多聚酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶、對(duì)拉米夫定耐藥的HBV-DNA多聚酶活性，還可與腺苷酸競(jìng)爭(zhēng)性摻入病毒DNA鏈，終止DNA鏈合成以抑制病毒復(fù)制［8］。國(guó)外研究顯示，ADV可有效抑制HBV復(fù)制，不僅對(duì)野生株有良好的抑制作用，對(duì)YMDD變異株也有明顯抑制作用，持續(xù)降低HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性的YMDD變異患者血清HBV-DNA和ALT水平，使患者獲得病毒學(xué)，肝臟生化功能和組織學(xué)的改善［9，10］。

DC是機(jī)體免疫應(yīng)答的主要啟動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。DC的主要作用是提呈抗原，而只有成熟的DC才具有提呈抗原的能力，DC的不成熟是導(dǎo)致免疫耐受的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者的樹突狀細(xì)胞存在成熟及功能異常，其功能缺陷將導(dǎo)致抗原無(wú)法被有效地提呈給CD+4輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，從而導(dǎo)致其激活特異性抗病毒免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力低下［11］。通過(guò)體外特異性抗原刺激DC，進(jìn)而活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可達(dá)殺傷HBV感染的宿主細(xì)胞的作用。輔助性T淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，Th1主因分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生急性自限性感染和HBV清除。Th2則主因分泌IL-4等細(xì)胞因子，引起體液免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生持續(xù)的慢性HBV感染，持續(xù)Th2型細(xì)胞因子分泌不利于病毒的清除，HBV感染致Th1/Th2細(xì)胞失衡，從而使Th1主導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能受到抑制［12］。IL-4和IFN-γ之間的平衡對(duì)于Th0分化為Th1或Th2起關(guān)鍵調(diào)控作用，外源性IL-4可使CD+4前體細(xì)胞向Th2效應(yīng)細(xì)胞分化，而IFN-γ則對(duì)前體細(xì)胞向Th2分化過(guò)程起抑制作用［13］。有學(xué)者報(bào)道在CHB患者抗病毒治療過(guò)程中，隨著HBV-DNA水平的下降，伴有IL-4水平的下降和IFN-γ水平的增加［14］。DC有效地激發(fā)T細(xì)胞活化，為慢性乙型肝炎免疫治療開辟了一條新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA改善值從4周末改善，在12、24周末明顯改善，IFN-γ水平在治療12周末明顯升高，在治療24周末達(dá)高峰，提示IFN-γ水平上升速度與HBV-DNA病毒載量下降速度相關(guān)。IL-4水平在治療過(guò)程中逐漸下降。在治療中可檢測(cè)到血清IFN-γ水平上升和IL-4水平下降，提示聯(lián)合治療可以促進(jìn)更多的Th1型細(xì)胞因子分泌，以利機(jī)體抗HBV免疫的恢復(fù)或增強(qiáng)，為清除病毒創(chuàng)造條件。

本研究提示，ADV聯(lián)合特異性樹突細(xì)胞疫苗在治療過(guò)程中，不僅能抑制乙肝病毒的復(fù)制，而且能調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，打破機(jī)體的免疫耐受，恢復(fù)T細(xì)胞功能。本文探討了阿德福韋聯(lián)合特異性樹突細(xì)胞疫苗治療過(guò)程中機(jī)體免疫細(xì)胞功能的動(dòng)態(tài)變化，表明聯(lián)合治療可直接抑制HBV-DNA合成，還可作為免疫調(diào)節(jié)劑，一定程度上改善CHB患者細(xì)胞因子的功能活性。在CHB治療過(guò)程中，細(xì)胞因子水平檢測(cè)可以作為血清學(xué)應(yīng)答的一項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并且細(xì)胞因子有望成為抗病毒治療的手段［15］。通過(guò)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，使Th2向Th1偏移，有利于機(jī)體的免疫應(yīng)答清除病毒，可作為設(shè)計(jì)治療CHB的策略。

1 Marcellin P，Chang TT，Lim SG，et al.Long-term efficacy and safety of adefovir dipivoxil for the treatmentof hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B.Hepatology，2008，48:750-758.

2 Tavakoli S，Schwerin W，Rohwer A，et al.Phenotype and function of monocyte derived dendritic cells in chronic hepatitis B virus infection.Gen Virol，2004，85:2829-2836.

3 Beckebaum S，Cicinnati VR，Zhang X，et al.Hepatitis B virus-induced defent ofmonocytederived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response In vitro:mechanisms for viral immune escape.Immunology，2003，109:487-495.

4 Akbar SM，Horiike N，Onji M，et al.Dendritic cells and chronic hepatitis virus carriers.Intervirology，2001，44:199-208.

5 Schiff ER.Prevention of mortality form hepatitis B and hepatitis C.Lancet，2006，368:896-897.

6 Perz JF，Amstrong GL，F(xiàn)arrington LA，et al.The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide.JHepatol，2006，45:529-538.

7 Benhamou Y.Treatment algorithm for chronic hepatitis B in HIV infected patients.JHepatol，2006，44:S90-S94.

8 Patrick M，Ting-Tsung C，Seng GL，et al.Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B.N Engl JMed，2003，348:808-816.

9 Schiffe，Laicl，Hadziyanniss，et al.Adefovir dipivoxil forwait-listed and post-liver transplantation patients with lamivudine-risistant hepatitis B:Final long-term restlts.Liver Transpl，2007，13:349-360.

10 Rappti I，Dmou E，Mitsoula P，et，al.Adding-on versus switching-to adefovir therapy in lamivudine-resistant HBeAg-negative chronic hepatitis B.Hepatology，2007，45:307-313.

11 張恒輝，何豫，趙鴻，等.樹突狀細(xì)胞體外刺激對(duì)HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85:1171-1176.

12 劉駿，盛吉芳.慢性乙型肝炎患者血清型細(xì)胞因子水平研究.國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2006，33:15-18.

13 Loggi E，Gramenzi A，Margotti M，et al.In vitro effect of thym osin-alphal and interferon-alpha on Th1 and Th2 cytokine synthesis in patients with eAg-negative chronic hepatitis B.J Viral Hepat，2008，15:442-448.

14 Wang J，Su B，Ding Z，et al.Cinetidine enhances inmune response of HBV DNA vaccination via inpaimentof the regulatory function of regulatory T cells.Biochem Biophys Res Canmun，2008，372:491-496.

15 任春鋒，沈燕，劉紅春.慢性病毒性乙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與T細(xì)胞亞群檢測(cè).鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43:988-990.