不同濃度HAES在正常人體外對IL-10和IL-12的影響

胡萬寧 甘建輝 毛瑞英 孫桂苓 宋雨婷 劉秀立 王春立 陳東

隨著血漿代用品的應(yīng)用日益廣泛，研究表明，羥乙基淀粉類血漿代用品(HAES)對體內(nèi)抗腫瘤免疫系統(tǒng)無不良影響［1］，并且術(shù)前輸注羥乙基淀粉能有地減輕手術(shù)和麻醉導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能的抑制［2］。但血漿代用品用于非惡性腫瘤患者的研究國內(nèi)外報道亦少見。本試驗試圖研究賀斯對健康者血液中免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子在體外的影響，以檢驗其是否抑制健康者的免疫系統(tǒng)。為羥乙基淀粉類血漿代用品的臨床應(yīng)用提供更廣泛的理論及試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3至12月河北省唐山市人民醫(yī)院健康志愿者30例，其中男18例，女12例;年齡25～40歲。在嚴(yán)格無菌的條件下，分別抽取靜脈血20ml入無菌試管，并以肝素抗凝，待用。在超凈臺內(nèi)分離出單個核細(xì)胞，計數(shù)后將細(xì)胞平均分成5組:1640培養(yǎng)液陰性對照組、10%血漿對照組、10%賀斯試驗組、20%賀斯試驗組、40%賀斯試驗組，然后再將各組分成陰性對照組、加脂多糖(LPS)、加植物血凝素(PHA)，使單個核細(xì)胞在不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后，1 500 r/min離心5 min后汲取上清液，待檢測。

1.2 試驗方法 應(yīng)用晶美生物工程(深圳)試劑盒行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各上清液中細(xì)胞因子IL-10和IL-12和的濃度。雙抗體夾心ELISA法(以IL-12為例):抗人IL-12單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-12與單抗結(jié)合，游離成分被洗去。同時加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素和生物素化的抗人IL-12抗體，生物素與親合素特異性結(jié)合，抗人IL-12抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-12結(jié)合形成免疫復(fù)合物，未結(jié)合部分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IL-12，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值;IL-12濃度與OD450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出標(biāo)本中IL-12的濃度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD450值作縱坐標(biāo)，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)曲線函數(shù)值計算各標(biāo)本的濃度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在不刺激淋巴細(xì)胞克隆的情況下，HAES各組與對照組的IL-10及IL-12濃度雖稍有參差，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);應(yīng)用LPS及PHA分別刺激B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的克隆后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。組內(nèi)比較:不刺激淋巴細(xì)胞克隆與應(yīng)用LPS及PHA分別刺激B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞克隆的IL-10及IL-12濃度兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、2。

表1 5組IL-10水平比較n=30，pg/m l，±s

表1 5組IL-10水平比較n=30，pg/m l，±s

注:與陰性對照比較，*P ＜0.05;與LPS比較，#P ＜0.05

組別 陰性對照LPS PHA 1640組 101±46 264±60* 481±90*#10%血漿組 150±46 303±66* 510±101*#10%血代組 139±41 297±60* 499±85*#20%血代組 129±34 278±50* 480±68*#40%血代組 134±40 271±66* 473±80*#

表2 5組IL-12水平比較n=30，pg/m l，±s

表2 5組IL-12水平比較n=30，pg/m l，±s

注:與陰性對照比較，*P ＜0.05;與LPS比較，#P ＜0.05

組別 陰性對照LPS PHA 1640組 93±41 233±81* 435±40*#10%血漿組 115±35 251±43* 457±75*#10%血代組 109±25 252±60* 472±65*#20%血代組 108±17 251±36* 450±45*#40%血代組 104±46 242±97* 439±62*#

3 討論

目前以羥乙基淀粉糾正大手術(shù)的低血容量、血液稀釋、改善血液流變學(xué)等已廣泛應(yīng)用于臨床，成為一種減少異體輸血的有效方法［3，4］。除補充容量外，常作為自體輸血和血液稀釋的一種替代物。相對于它的前兩代，賀斯不僅能增加血漿容量、改善心排血量和體內(nèi)的氧運輸，改善創(chuàng)傷或血容量不足患者的器官功能和全身血液動力學(xué)狀態(tài)，而且維持容量效應(yīng)的時間較長，降解迅速，在體內(nèi)存留時間短，可避免凝血機制的損害［5-7］。

合成培養(yǎng)基是按人和動物體內(nèi)細(xì)胞所需成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。細(xì)胞生活在合成培養(yǎng)基中健康透明，利于延長細(xì)胞在體外存活的時間。RPMI 1640是一種常用的培養(yǎng)液，其主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其他輔助物質(zhì)。有絲分裂原(mitogen)來自植物蛋白或細(xì)菌產(chǎn)物，它能與多種細(xì)胞膜糖類及寡糖基分子結(jié)合，后者為促使有絲分裂原受體，結(jié)合后能促使細(xì)胞活化和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂。LPS為一種有絲分裂原，在B淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞表面均有其受體，能選擇性的刺激B淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞克隆;PHA為另一種有絲分裂原，在T淋巴細(xì)胞表面有其受體，能選擇中分子性刺激T淋巴細(xì)胞克隆。

IL是一組由淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和其他非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)白細(xì)胞與其他細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子。目前已經(jīng)確認(rèn)有23種不同的白介素，其重要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、促進(jìn)免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎性反應(yīng)［8］。IL-10是18.7 kD酸性蛋白，主要由TH2、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，它可以抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ和白介素-2(IL-2)，同時也可以抑制T細(xì)胞增殖作為炎性遞質(zhì)的單核因子的產(chǎn)生，以及由T細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子［9］。IL-12是一種分子量70～75 kD的糖蛋白。IL-12是發(fā)動細(xì)胞免疫的細(xì)胞庫。主要由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)B細(xì)胞合成分泌免疫球蛋白(Ig)及Ig類別轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TC)、自然殺傷細(xì)胞、淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞增殖分化，增強殺傷能力［10］。

本試驗結(jié)果顯示:1640培養(yǎng)液組明顯較其他組IL-10、IL-12濃度低，說明雖然1640培養(yǎng)液含有多種氨基酸、碳水化合物、維生素、無機離子及小牛血清，但其較人體內(nèi)環(huán)境仍有一定的差距。試驗組與血漿組的濃度值較接近，但比較中發(fā)現(xiàn)10%的賀斯組與10%的血漿組的濃度值更近似。

其次，不刺激淋巴細(xì)胞克隆與應(yīng)用LPS及PHA分別刺激B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的克隆三種條件下，兩種細(xì)胞因子的濃度值迥然不同，又互有聯(lián)系:(1)在IL-10，血漿濃度測定范圍是(150 ±46)pg/ml，加 LPS后，濃度增至(303 ±66)pg/ml，為前者的2倍，這是由于加LPS后B淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞克隆明顯增加，一方面直接增加IL-10的產(chǎn)生，另一方面增加其他細(xì)胞因子的釋放，并作用于T淋巴細(xì)胞，刺激其增殖與分化，間接增加IL-10的產(chǎn)生，導(dǎo)致了IL-10濃度的明顯提高;加PHA后，濃度增至(510±101)pg/m l，為前者的4～5倍，這是由于加用PHA后，可明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的克隆增殖，使T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，因此導(dǎo)致IL-10產(chǎn)生顯著增加。然而，IL-10主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，因此導(dǎo)致了加LPS后IL-10的濃度變化不如加PHA的明顯。(2)在IL-12，血漿濃度測定范圍是(115 ±35)pg/ml，加 LPS 后，濃度增至(251 ±43)pg/m l，為前者的2倍，這是由于加LPS后B淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞克隆明顯增加，一方面直接增加IL-12的產(chǎn)生，另一方面增加其他細(xì)胞因子的釋放，并作用于T淋巴細(xì)胞，刺激其增殖與分化，間接增加IL-12的產(chǎn)生，導(dǎo)致了IL-12濃度的明顯提高;加PHA后，濃度增至(457±75)pg/ml，為前者的4倍，這是由于加用PHA后，可明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的克隆增殖，使T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，因此導(dǎo)致IL-12產(chǎn)生顯著增加。然而，IL-12主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，因此導(dǎo)致了加LPS后IL-12的濃度變化不如加PHA的明顯。

綜上所述，不刺激淋巴細(xì)胞克隆與應(yīng)用LPS及PHA分別刺激B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的克隆三種條件下，HAES各組與對照組中兩種細(xì)胞因子的濃度無顯著性差異，提示三個濃度的賀斯在體外環(huán)境中不影響免疫細(xì)胞的生存、克隆及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，即:HAES在體外試驗中不抑制正常人體免疫系統(tǒng)機能。因而，HAES應(yīng)用于手術(shù)患者圍術(shù)期以減少異體輸血、保護其免疫狀態(tài)是安全可行的。

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