注射用氨磷汀安全性研究

(河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003)

注射用氨磷汀是一種有機(jī)硫化磷酸化合物，在組織中被與細(xì)胞膜結(jié)合的堿性磷酸酶水解脫磷酸后成為具有活性的代謝產(chǎn)物WR－1065，所含巰基具有清除組織中自由基的作用，能降低順鉑、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素等藥物的毒性[1]，故筆者根據(jù)藥物分類及注射劑研制要求，結(jié)合注射劑安全性試驗指導(dǎo)原則，對注射用氨磷汀做了安全性試驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 藥物和試劑

注射用氨磷汀(批號為20090301，規(guī)格為0.4 g/瓶，河南省大明制藥有限公司);氯化鈉注射液(批號為090212211，鄭州永和制藥有限公司);牛血清白蛋白(批號為32093239，北京索萊寶科技有限公司);依文思藍(lán)(批號為87－04－01，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝);甲醛(天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.2 動物

豚鼠，普通級，體重300～400 g(雌雄不拘)，購自北京沙河通利試驗動物養(yǎng)殖場，許可證號為SCXK(京)2005－0003;SD大鼠，清潔級，體重180～220 g(雌雄各半)，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2005－0001;日本大耳白家兔，普通級，體重2.0～3.0 kg(雌雄不拘)，購自河南省康達(dá)實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(豫)2005－0002。雌雄動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水。環(huán)境溫度(23±2)℃，相對濕度50% ～65%，12 h光照明暗交替，通風(fēng)良好。

1.3 儀器

CP225D型電子天平(德國Sartorius公司);PB4002－S型電子天平(瑞士Mettler Toledo儀器有限公司);SF2000型三按鍵電子數(shù)顯卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司);RTZ－10A－RT型嬰兒秤(無錫市衡器廠);DR－HW－1型電熱恒溫水溫箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠);CH30型顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 全身主動過敏性試驗(ASA)

取健康豚鼠24只，隨機(jī)分為4組(每組6只):陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組給予0.5%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為163 mg/kg，激發(fā)劑量為326 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為81 mg/kg，激發(fā)劑量為163 mg/kg;給藥質(zhì)量濃度均為57 g/L。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀0.5 mL(高劑量組致敏容積為1.0 mL)，共3次，進(jìn)行致敏，然后各組再分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日由耳緣靜脈注射注射用氨磷汀1.0 mL進(jìn)行攻擊(高劑量組激發(fā)容積為2.0 mL)。每日觀察動物的癥狀，靜脈注射后30 min內(nèi)觀察每只動物的癥狀反應(yīng)，根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷[2－4]。結(jié)果陽性對照組6只豚鼠均出現(xiàn)過敏反應(yīng)，為極強(qiáng)陽性(++++);陰性對照組和注射用氨磷汀高、低劑量組豚鼠均未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

2.2 被動皮膚過敏性試驗(PCA)

抗體制備:取大鼠8只，隨機(jī)分為4組(每組2只):陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組給予1%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質(zhì)量濃度為20 g/L，致敏劑量為200 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質(zhì)量濃度為10 g/L，致敏劑量為100 mg/kg(均以0.9%氯化鈉注射液復(fù)溶)。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀每100 g體重1.0 mL/100 g，共3次，進(jìn)行致敏。末次致敏后10 d采血，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理10 min，分離血清，合并每組大鼠血清，分別制得混合抗血清，－20℃保存，2周內(nèi)備用。

試驗方法:取大鼠24只，隨機(jī)分為4組(每組6只)，分組及給藥方法同抗體制備項下方法。試驗前，動物背部脫毛3 cm×4 cm，然后皮內(nèi)注射各對應(yīng)組的抗血清0.1 mL(抗血清的稀釋度為1∶2)，進(jìn)行被動致敏。48 h后分別在各組尾靜脈注射含1%依文思藍(lán)的對應(yīng)供試品，給藥容積均為每100 g體重0.5 mL。30 min后脫臼處死各組動物，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層藍(lán)色反應(yīng)斑的直徑，并進(jìn)行比較。

結(jié)果:陽性對照組大鼠藍(lán)斑直徑大于5 mm，為(6.63±1.66)mm，呈陽性;高劑量組為(1.06±1.66)mm，陰性對照組和注射用氨磷汀低劑量組大鼠藍(lán)斑直徑小于5 mm，呈陰性。

2.3 體外溶血試驗

2%紅細(xì)胞懸液配制:取健康家兔1只，自心臟取血10 mL左右，放入含玻璃珠的干燥三角燒瓶中，振搖10 min，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。將去纖維蛋白血移入刻度離心管內(nèi)，加5%葡萄糖注射液約10倍量，搖勻，以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心處理15 min，傾去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用5%葡萄糖注射液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞按其容積用5%葡萄糖注射液配成2%的混懸液。

試驗方法:取潔凈試管7支，編號，1號至5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按表1依次加2%紅細(xì)胞懸液、5%葡萄糖注射液、純化水、受試藥物，混勻后立即置(37±0.5)℃的水浴鍋內(nèi)溫育。開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，最長觀察3 h。

結(jié)果:陽性對照管有溶血發(fā)生，溶液呈澄明紅色，管底幾無紅細(xì)胞殘留;陰性對照管和注射用氨磷汀各管均無溶血和凝聚發(fā)生，紅細(xì)胞全部下沉，上清液無色澄明。顯微鏡下觀察，陰性對照管和注射用氨磷汀各管紅細(xì)胞形態(tài)正常。

表1 體外溶血試驗加藥方法

2.4 血管刺激性試驗

取健康家兔4只，采用同體左右側(cè)自身對比法，于左側(cè)耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，右側(cè)耳緣靜脈緩緩注射氨磷汀40 mg/kg，給藥質(zhì)量濃度為20 g/L，給藥容積均為2.0 mL/kg，1天1次，連續(xù)5 d。每天給藥前及末次給藥后48，72，96 h對動物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察，觀察期結(jié)束時，取2只動物的耳緣靜脈近心端血管2～3 cm供病理組織學(xué)檢查，留下的2只動物繼續(xù)觀察14 d再進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。在規(guī)定的時間內(nèi)觀察，結(jié)果家兔雙側(cè)耳未見明顯充血水腫，血管均正常。病理組織學(xué)檢查顯示，給藥結(jié)束時左耳鱗狀上皮無增生、萎縮、上皮下無充血、水腫及炎癥。恢復(fù)14 d后各動物左右耳均未見血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤，提示本品對家兔血管無刺激性。

3 討論

注射藥物的安全性評價是藥物臨床前試驗研究的一個重要組成部分，主要由過敏性試驗、體外溶血試驗、血管刺激性試驗等組成，其試驗方法和評定標(biāo)準(zhǔn)可參照2005年國家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。

本試驗受試藥物劑量依據(jù)注射用氨磷汀使用說明書，用于化學(xué)治療患者最大劑量，按體表面積一次600 mg/m2，溶于0.9%氯化鈉注射液50 mL中靜脈滴注。計算的人用劑量為16.2 mg/kg(按60 kg體重計)，折算成動物等效劑量。在預(yù)試驗給予此劑量未發(fā)生毒性反應(yīng)的原則下，將此劑量設(shè)為受試物低劑量的致敏劑量，受試物高劑量則給予低劑量的數(shù)倍量，本試驗設(shè)定的高劑量為低劑量的2倍量，激發(fā)劑量一般為致敏劑量的2～5倍。

試驗結(jié)果顯示，注射用氨磷汀對紅細(xì)胞未見溶血和凝聚作用，全身主動過敏試驗及被動皮膚過敏性試驗均未見過敏反應(yīng)，家兔靜脈注射給藥后未見血管刺激性，說明本品安全性良好，可靜脈注射給藥。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪK.

[2]陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:157.

[3]徐叔云，卞如廉，陳 修.藥理實驗方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:237.

[4]袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997:46.