金絲桃苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

(中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400038)

肝臟損傷是指由多種有害因子和物質(zhì)引起的肝臟病理和生理異常，每年因肝病死亡的人數(shù)約為30萬人，但目前尚無可有效減輕肝臟損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的藥物。金絲桃苷(hyperin，HP)廣泛存在于藤黃科、杜鵑花科、豆科及衛(wèi)矛科等多種植物的黃酮醇苷化合物中，已在20多種植物中被發(fā)現(xiàn)。藥理研究表明，金絲桃苷具有較好的鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，以及較強(qiáng)的抗氧化作用，本研究旨在探討金絲桃苷對(duì)四氧化碳(CCl4)誘導(dǎo)化學(xué)性肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

722s型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);450型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio－Rad公司)。金絲桃苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111521－200303);CCl4購(gòu)于Sigma公司;天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20070312，20070402，20071029，20071010);噻唑藍(lán)(Amresco 公司，北京拜爾迪生物公司分裝);二甲基亞砜(DMSO，天津化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷所需CCl4適宜濃度的確定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L－02人肝細(xì)胞，消化后用RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，肝細(xì)胞活力大于90%。加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，于37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，肝細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)后待用。以CCl4原液4.82 mL溶于DMSO 5.18 mL，制成5 mol/L的CCl4液，以含 10%胎牛血清的 RPMI－1640 液稀釋配成含 2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0 mmol/L CCl4的溶液。加入96孔培養(yǎng)板，以無CCl4的RPMI－1640培養(yǎng)基為空白對(duì)照。每個(gè)濃度做5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，以四甲基偶氮唑藍(lán)微量酶反應(yīng)比色(MTT)法測(cè)肝細(xì)胞存活率。以空白對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，CCl4濃度為2.5 mmol/L時(shí)，MTT檢測(cè)顯示肝細(xì)胞存活率為90.9%，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。隨著CCl4濃度的升高，肝細(xì)胞存活率逐漸降低，且肝細(xì)胞逐漸出現(xiàn)核溶解、細(xì)胞膜破損、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。當(dāng)CCl4濃度達(dá)到30.0 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞存活率僅為11.36%。最理想的CCl4造模濃度為 15.0 mmol/L，可較好地顯示CCl4肝細(xì)胞損傷與保護(hù)因子作用的差異。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度CCl4損傷后肝細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果(n=5)

2.2 金絲桃苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，將肝細(xì)胞懸液加入96孔和24孔培養(yǎng)板中，于37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，肝細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)后供試驗(yàn)用。設(shè)CCl4模型組(終濃度為15 mmol/L)、金絲桃苷(5，10，20，40，80，160 μg/mL)+CCl46 個(gè)處理組、空白對(duì)照組、維生素E(終濃度為50 μmol/L)+CCl4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別加入CCl4、不同質(zhì)量濃度的金絲桃苷、維生素E及培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集24孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞待測(cè)，同時(shí)用MTT法測(cè)定96孔板肝細(xì)胞的存活率。取肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書，采用賴氏法測(cè)定ALT及AST。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)液，加0.5 mL 1%Triton－100裂解細(xì)胞，充分吹打混勻后收集，2 500 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明測(cè)定谷胱甘肽(GSH)、MDA含量測(cè)定。結(jié)果見表2及表3。CCl4誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞后，促進(jìn)胞內(nèi)酶的釋放，CCl4模型組培養(yǎng)上清液中的ALT及AST水平較正常明顯升高，肝細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，GSH水平及肝細(xì)胞存活率明顯下降。隨著培養(yǎng)液中金絲桃苷質(zhì)量濃度遞增，其肝細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)逐漸明顯，并呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。80 μg/mL的金絲桃苷已能顯著抑制CCl4誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞后ALT及AST水平的上升，降低損傷肝細(xì)胞中MDA含量，顯著升高肝細(xì)胞內(nèi)GSH水平及肝細(xì)胞存活率，且效應(yīng)強(qiáng)度與維生素E對(duì)照組相當(dāng)。

3 討論

3.1 CCl4誘導(dǎo)肝臟氧化性損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇

金絲桃苷具有一定的抗氧化活性，為確定該活性是否有助于金絲桃苷在氧化性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。在大量查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，決定選用CCl4作為肝臟致毒因素[1－2]。CCl4是經(jīng)典的氧化性肝損傷致毒劑，其致毒機(jī)制:一是激活肝微粒體內(nèi)依賴于CYP450的混合功能氧化酶，產(chǎn)生三氯甲基(－CCl3)、二氯甲基(－CCl2)和過氧化甲基(－CCl3OO)等自由基，致細(xì)胞DNA鍵斷裂，并引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致MDA形成增多，肝細(xì)胞膜通透性增加，使位于細(xì)胞漿中及線粒體中的ALT與 AST釋放;二是可促進(jìn)GSH等抗氧化物的消耗，導(dǎo)致氧自由基損傷進(jìn)一步加重，最終使肝細(xì)胞死亡[3－4]。因此，采用CCl4制備體外肝細(xì)胞和大鼠肝損傷模型，可以較明確地反映金絲桃苷的抗氧化活性。

表2 金絲桃苷對(duì)CCl4損傷肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT及AST測(cè)定結(jié)果(U/L)

表3 金絲桃苷對(duì)CCl4損傷肝細(xì)胞MDA及細(xì)胞存活率的影響

3.2 金絲桃苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)L－02人肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

離體細(xì)胞試驗(yàn)的影響因素相對(duì)較少，可控性強(qiáng)，能準(zhǔn)確反映處理因素對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷的效應(yīng)。試驗(yàn)中對(duì)CCl4的致肝損傷劑量進(jìn)行了摸索。目前文獻(xiàn)報(bào)道的肝細(xì)胞損傷的CCl4適宜終濃度在5～20 mmol/L不等[5－7]，而找到適宜的造模濃度(既可有效誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，又可較好反映保護(hù)劑的肝保護(hù)作用至關(guān)重要)?？疾炝薈Cl46 個(gè)濃度(2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0 mmol/L)的肝細(xì)胞損傷效應(yīng)，結(jié)果CCl4濃度不高于10 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞損傷不明顯，細(xì)胞存活率大于60%，可能會(huì)夸大保護(hù)劑的保護(hù)作用;CCl4濃度不低于20 mmol/L時(shí)，肝細(xì)胞損傷變形嚴(yán)重，細(xì)胞存活率低于20%，無法準(zhǔn)確反映保護(hù)作用。因此，最終確定15 mmol/L為最佳造模濃度。

采用體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞株L－02的試驗(yàn)結(jié)果顯示，金絲桃苷質(zhì)量濃度在20 μg/mL到160 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，劑量為80 μg/mL時(shí)肝細(xì)胞保護(hù)作用已極顯著(P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)MDA含量及其釋放AST和ALT明顯減少，胞內(nèi)GSH含量和細(xì)胞活性則明顯提高，效應(yīng)強(qiáng)度與維生素E對(duì)照組相當(dāng)，表明金絲桃苷對(duì)CCl4所致肝細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。細(xì)胞中MDA的含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映肝細(xì)胞的損傷程度，而GSH是機(jī)體清除－CCl3的關(guān)鍵物質(zhì)，因此推測(cè)其保護(hù)機(jī)制可能與金絲桃苷的抗氧化作用密切相關(guān)。為獲得抗氧化的直接證據(jù)，課題組對(duì)金絲桃苷是否通過清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成，從而達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體膜的完整性的研究尚在進(jìn)行中。

[1]徐 穎，馬 軼，陳 飛，等.金絲桃苷對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(5):365－367.

[2]李慶林，陳志武，馬傳庚.金絲桃苷對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺氧－再給氧損傷的影響[J].中草藥，2006，37(4):575－577.

[3]Clawson GA.Mechanisms of carbon tetrachloride hepatotoxicity[J].Pathol Immunopathol Res，1989，8(2):104－112.

[4]Boll M，Weber LW，Becker E，et al.Mechanism of carbon tetrachloride－induced hepatotoxicity.Hepatocellular damage by reactive carbon tetrachloride metabolites[J].Z Naturforsch C，2001，56(7－8):649－659.

[5]潘 勤，李定國(guó)，杜學(xué)良，等.生長(zhǎng)抑素及奧曲肽的肝細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(4):730－733.

[6]焦 楊，段小群，林 興，等.玉郎傘多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(11):1 333－1 335.

[7]陳 蕾，吳 皓，姚靜倩，等.珠蚌多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)海洋藥物雜志，2008，27(2):18－21.