熒光分光光度法檢測(cè)維庫(kù)溴胺的血藥濃度

趙 麗，郭越潔，張勤功，趙真英

(1.山西省腫瘤醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030013; 2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001)

維庫(kù)溴胺是一種中短效非去極化肌松藥，主要優(yōu)點(diǎn)是恢復(fù)速率快和無(wú)心血管副作用[1]，目前已成為臨床麻醉中最常用的非去極化肌松藥之一。測(cè)定維庫(kù)溴胺的血藥濃度，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。為適應(yīng)臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的需要，筆者建立了測(cè)定維庫(kù)溴胺血藥濃度的熒光分光光度法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

美國(guó)瓦里安熒光分光光度計(jì);GL－88 B型旋渦震蕩器;高速冷凍離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);微量加液器。維庫(kù)溴胺標(biāo)準(zhǔn)品(浙江仙琚制藥有限公司)，需當(dāng)日配制;四氯四碘熒光素應(yīng)用液(0.5 g/L)，使用前需純化，當(dāng)日配制;0.2 mmol/L碳酸緩沖液，pH為10.5;氯仿、丙酮等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 熒光分析條件選擇

精密量取維庫(kù)溴胺適量，置量瓶中，用水溶解并稀釋成1 g/L的貯備液備用。精密量取維庫(kù)溴胺貯備液置量瓶中，加水稀釋成1μg/mL的溶液，置熒光分光光度計(jì)上掃描(激發(fā)、發(fā)射狹縫均為10 nm)激發(fā)光譜及發(fā)射光譜。結(jié)果見圖1，最大激發(fā)波長(zhǎng)為550.00 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590.00 nm。

圖1 維庫(kù)溴胺的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

2.2 樣品提取

取肝素抗凝全血，用高速冷凍離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min，吸取上清血漿1 mL，保存在－20℃條件下，備用。

2.3 生化測(cè)定步驟

選用帶塞塑料離心管，依次加入內(nèi)含維庫(kù)溴胺的標(biāo)準(zhǔn)液或血漿1 mL，碳酸氫鈉緩沖液1 mL，熒光素工作液0.5 mL，氯仿7 mL，每加入1種試劑后均需要在液體混合器上充分混勻;將離心管放置在震蕩器上震蕩2 min;將離心管放置在高速冷凍離心機(jī)中，選擇10 000 r/min，10℃ 條件離心10 min;離心完畢，吸棄上清水相，精確吸取有機(jī)相0.5 mL，置內(nèi)含3.5 mL丙酮的帶塞玻璃管，充分混勻后待測(cè)定。熒光測(cè)定選擇激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為550/590 nm，狹縫10 nm。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系:取維庫(kù)溴胺貯備液，精密配置成質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.50，1.00，1.50，2.00 μg/mL 的溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。維庫(kù)溴胺質(zhì)量濃度在0.05～2.00 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。在水溶液中，測(cè)定的熒光強(qiáng)度與藥物質(zhì)量濃度之間的回歸方程為 Y(熒光強(qiáng)度)=3.247+5.63 × 水中藥物質(zhì)量濃度(μg/mL)，r=0.997 6。在試管中分別加入1 mL空白血漿，再加入維庫(kù)溴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血藥濃度相當(dāng)于 0.05，0.10，0.50，1.00，1.50，2.00 μg/mL，按 2.3 項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，血漿中熒光強(qiáng)度與藥物質(zhì)量濃度之間的回歸方程為Y(熒光強(qiáng)度)=1.235+4.01 ×血藥濃度(μg/mL)，r=0.995 8。

穩(wěn)定性:配制維庫(kù)溴胺血漿標(biāo)本質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，考察血漿樣品在－20℃條件下，保存0，2，5，10 d及室溫放置2 h的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。

表1 血漿標(biāo)本放置后質(zhì)量濃度變化(n=6)

精密度:分別配制含維庫(kù)溴胺的低、中、高3種質(zhì)量濃度(0.1，1.0，2.0μg/mL)的血漿標(biāo)本各6份，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。結(jié)果見表2。

提取回收率:配制含不同質(zhì)量濃度的維庫(kù)溴胺標(biāo)準(zhǔn)血樣，經(jīng)萃取后測(cè)定其熒光強(qiáng)度，同法測(cè)定不經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)維庫(kù)溴胺熒光強(qiáng)度，用經(jīng)萃取后測(cè)定的熒光強(qiáng)度值除以不經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)維庫(kù)溴胺的熒光強(qiáng)度乘以100%，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表2。

表2 人血漿中藥物濃度測(cè)定精密度及回收率(n=6)

方法回收率:分別配制質(zhì)量濃度為 0.10，1.00，2.00 μg/mL 的血漿樣品，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定的維庫(kù)溴胺熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出測(cè)定藥物質(zhì)量濃度，按測(cè)定量/添加量乘以100%計(jì)算方法回收率。結(jié)果見表2。

檢測(cè)限:本方法能夠測(cè)出的維庫(kù)溴胺最低血藥濃度為0.05 μg/mL，類似于文獻(xiàn)[2－3]報(bào)道的結(jié)果。

3 討論

本研究建立了檢測(cè)血漿維庫(kù)溴胺質(zhì)量濃度的熒光分光光度法，專屬性強(qiáng)，分離完全，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。該法相對(duì)回收率大于96%，絕對(duì)回收率大于80%，日內(nèi)、日間精密度 RSD均小于8%，符合生物等效性指導(dǎo)原則關(guān)于生物樣品分析方法的基本要求，可用于人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物等效性試驗(yàn)的血藥濃度檢測(cè)。

試驗(yàn)中要注意溫度的影響。由于維庫(kù)溴胺在血漿中不太穩(wěn)定，極易降解，所以血樣應(yīng)在－20℃以下冰箱儲(chǔ)存，長(zhǎng)期儲(chǔ)存應(yīng)放置在－70℃冰箱。在提取中應(yīng)選用低溫高速離心(10℃，10 000 r/min)，以減少藥物的分解，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。

所配制的熒光素貯備液于黑暗、4℃保存時(shí)相對(duì)較穩(wěn)定，但含量也會(huì)逐漸下降，應(yīng)在4 d內(nèi)使用為宜。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，貯備液所配制的應(yīng)用液穩(wěn)定性很差，故熒光素應(yīng)用液應(yīng)當(dāng)日配制，即配即用。

由于熒光分光光度法對(duì)試劑純度、實(shí)驗(yàn)用水和試管等玻璃器皿潔凈度要求非常高，故所用玻璃器皿等均需經(jīng)硝酸浸泡，且務(wù)必多次洗刷干凈。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，本法樣品預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單，回收率高，線性范圍寬，測(cè)定方法精密度高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適于臨床和科研應(yīng)用，可作為測(cè)定維庫(kù)溴胺血藥濃度的常規(guī)方法。

[1]LienCA.Rationaluseofmusculerelaxants[J].AnesthAnalg，1994，6:66－72.

[2]Kersten UW，Meijer DKF，Agoston S.Fluorimetric and chromatographic determination of pancuronium bromide and its metabolites in biological materials[J].Clini Chimi Acta，1973， 44(1):59－66.

[3]Rupp SM，Castagnoli KP，F(xiàn)isher DM，et al.Pancuronium and vecuronium pharmacokinetics and pharmacodynamics in younger and elderly adults[J].Anesthesiology，1987，67(1):45－49.