運動減肥對肥胖兒童少年紅細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻及ATPase酶活性的影響

賴愛萍，陳文鶴

1 前言

隨著全球兒童少年肥胖率的增加，兒童少年期肥胖對健康造成的危害越來越引起重視。兒童少年肥胖特別是兒童期后幾年和青春期時的肥胖以及隨之而來的健康風險會延續(xù)到成年，一些過去認為只有在成人期才會出現的慢性疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥等已經在肥胖兒童少年中出現，提示了肥胖對兒童少年糖、脂代謝的負面影響，血脂異常和高胰島素血癥是目前在肥胖兒童少年中最常見的糖、脂代謝紊亂表現。然而，在實際觀察中，不是所有的肥胖兒童少年特別是年紀較小的兒童中其血脂和脂蛋白水平都會被即時檢測出異常，但這并不能說明這些肥胖者脂代謝正常，而可能是因為脂代謝紊亂的早期尚不足以引起血脂的變化。事實上，由于紅細胞膜結構和功能特點，在肥胖兒童少年血脂水平尚在正常范圍值之時，紅細胞膜脂質成分可能已經發(fā)生了異常變化。正常紅細胞膜脂質雙層中脂類分子呈不對稱性分布，其外層脂類富含卵磷脂（PC)和鞘磷脂（SM)，內層脂類以磷脂酰絲氨酸（PS)和腦磷脂（PE)為主，但異常情況下（如細胞凋亡)PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中，稱為紅細胞膜磷脂外翻（PS外翻)。研究顯示，膜脂質改變會通過紅細胞膜 PS外翻量的變化體現出來[15]，而肥胖者所處的高氧化壓力可能會誘導其增加[8]，對肥胖兒童少年紅細胞膜PS外翻的研究迄今為止未見報道，也未見運動減肥所致的體重下降對其影響的報道，本研究通過流式細胞技術研究肥胖兒童少年紅細胞膜PS外翻水平及運動減肥干預對其的影響，并結合運動前后膜ATPase酶活性的改變分析紅細胞膜氧化壓力的變化，為早期監(jiān)測兒童少年脂代謝紊亂以及探討運動減肥對脂代謝影響的機制提供理論依據。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

參加2008年上海暑期封閉運動減肥夏令營的肥胖兒童少年64名，均為華東地區(qū)漢族人，入營前除了參加各自校內規(guī)定的體育課以外均無額外的體育鍛煉。年齡14.08 ±3.91歲，BM I 29.34±4.90，其中男性27名，年齡13.41 ±3.62歲，女性37名，年齡14.55±4.08歲。根據生物電阻抗法所測得的體脂百分比將研究對象分為3組：輕度肥胖組（30％～35％)、中度肥胖組（35％～40％)和重度肥胖組（＞40％)。入營前均接受專業(yè)醫(yī)生體格檢查和病史詢問，否認傳染病史和重要臟器疾病史，否認曾使用減肥藥物疾病史。本研究過程經上海體育學院倫理委員會批準，獲受試者本人及家長同意并簽署書面同意書。

2.2 研究方法

入營后每位營員的飲食均由專業(yè)營養(yǎng)人士根據各自實際情況和兒童少年發(fā)育特點進行配餐和分餐，熱能供給比例約為糖∶脂肪∶蛋白質=60％～70％∶10％～15％∶20％～25％，每天用鹽＜6 g，保證營養(yǎng)素供能的均衡合理、熱能的充足攝入以及食物來源的多樣化并進行每周定期的健康教育。2天飲食適應期后作清晨空腹肘靜脈取血共13 ml，3 m l置分離膠促凝管測血脂6項，4 ml置肝素抗凝管，取0.2 ml做流式分析 PS外翻量，其余離心取紅細胞膜，取血后由專人對營員做身體形態(tài)測試，測試過程均在上海市民體質中心完成。4周有氧運動減肥結束后對上述指標再次檢測，第2次的測試安排在有氧運動結束后的第2天清晨（約距前1天運動結束18～20 h)，以此避免急性運動的影響。

2.2.1 運動處方

為制定合理的運動處方，每位受試者均先進行遞增運動負荷試驗：安靜心電圖描記后受試者在平板跑臺進行4 km/h，6 km/h和8 km/h 3個遞增定量負荷的運動試驗，每級負荷持續(xù)2 min后，描記負荷后即刻心電圖。若心電圖出現明顯異常、或心率超過最大心率的80％、或受試者主觀無法繼續(xù)堅持試驗時終止試驗。運動負荷試驗結束后描記運動后1 min的恢復心電圖，在此基礎上，由運動專家開設個人運動處方。入營后按此運動處方進行為期4周的有氧運動，運動減肥的運動強度大約在心率儲備的20％～40％（心率儲備=最高心率-安靜心率)，運動強度的個體差異較大，一般不宜超過40％，即運動減肥的運動強度較小，運動減肥采用中、小強度運動的原因在于減肥運動必須保證充分的氧供應[1]。運動頻率為每周6天，包括晨練，每天2次，運動時間持續(xù)為4周。每次運動時間為120 min（上午：10：00—12：00；下午：15：00—17：00)，包括準備活動、正式運動、整理活動。運動形式選擇強度易控制且簡單易學的方式如球類、游泳、健身操等。POLAR表用于監(jiān)測運動中心率并由運動人體科學本科以上背景的人員進行全程運動強度跟蹤監(jiān)控，專業(yè)醫(yī)務人員做運動醫(yī)務監(jiān)督。

2.2.2 血脂6項的檢測

總膽固醇（TC)用酶反應法、甘油三酯（TG)用乙酰丙酮微量測定法、低密度脂蛋白（LDL-C)用聚乙烯硫酸沉淀法、高密度脂蛋白（HDL-C)用磷鎢酸鎂測定法、載脂蛋白A（APO-A)和載脂蛋白B（ApoB)用免疫透射比濁法。均在全自動生化分析儀上完成。

2.2.3 紅細胞膜 ATPase活性（Na+K+-ATPase和 Ca2+Mg2+-ATPase)的測定

1.紅細胞膜制備：肝素抗凝血放4℃離心機以4 000 rpm離心15 min，去除上層白色絨毛狀膜成分（即白細胞等)后將壓積紅細胞用p H為7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（比例約1∶3)洗滌吹打，重復離心后視紅細胞洗滌情況沖洗2～3次，獲得壓積紅細胞。加p H為7.4的低滲tris緩沖液破膜，在4℃冰箱中靜置3h后放4℃高速離心機上以12 000 rpm離心30 min，小心吸去暗紅色上清液，粉紅色沉淀部分再加入低滲tris緩沖液混合均勻后重復離心，可見白色沉淀（紅細胞膜)，吸上清及離心管底部褐色的纖維蛋白樣沉淀斑丟棄，將所制白色血影膜用蒸餾水懸浮，分裝于EP管中待測酶活性。

2.酶活性測定：參照南京建成《超微量ATP酶測試盒（Na+K+-ATPase+Ca2+Mg2+-ATPase)測定試劑盒說明書》。所需儀器——722可見分光光度計，SHHW數字顯示式恒溫水浴箱。

2.2.4 磷脂酰絲氨酸（PS)外翻的檢測

Annexin-V是一種分子量為35～36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與 PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC)標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測 PS外翻。本研究使用Beckman Coulter Annexin V-FITC kit試劑盒，采用 Annexin V法進行檢測，測定過程參照Beckman Coulter“Annexin VFITC kit說明書”。

2.3 統(tǒng)計學分析

所有數據均在SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包里完成，所測數據用均數±標準差（±S)表示。數據進行統(tǒng)計分析前先做同質性檢驗，方差不齊者先經對數轉換后取所得的數據進行下一步分析。運動干預前后比較采用配對t檢驗，運動前各指標相關性分析用 Pearson相關統(tǒng)計法，不同肥胖度人群之間比較用單因素方差分析（ANOVA)。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗，顯著性水平為P≤0.05，非常顯著性水平為P≤0.01。

3 結果

3.1 流式細胞技術所測肥胖兒童少年 PS外翻過程（圖1、圖2)

3.2 不同肥胖度血脂及膜脂水平的ANOVA結果（僅列出有差異性的數據)（表1)

可見不同肥胖度的 PS外翻、HDL有顯著差異，而其他指標如 TC、TG等組間均無顯著差異（未在表1中顯示)。

3.3 肥胖兒童少年運動前血脂、膜PS外翻、形態(tài)指標以及酶活性之間的關系（表2)

相關分析發(fā)現，TG與BM I及WC、WHR正相關，與以往研究類似。TG與Na+K+-ATPase負相關，而后者與WHR負相關（r=-0.354，P≤0.05，表2中未顯示)，Ca2+Mg2+-ATPase與Fat％負相關（r=-0.37，P≤0.05，表2中未顯示)，這些提示了肥胖引起酶活性降低，后者又影響了血脂水平。PS外翻與收縮壓相關系數為0.498，但未達顯著性意義（P= 0.07，表2中未顯示)，也并未發(fā)現PS外翻與酶活性的直接相關。

3.4 運動干預前后受試者血脂、紅細胞膜 PS外翻量及ATP酶活性變化（表3)

圖1 獲取紅細胞示意圖

圖2 紅細胞PS外翻的表達示意圖

表1 不同肥胖度兒童少年人群血脂及膜PS外翻ANOVA結果一覽表

表2 肥胖兒童少年運動前各指標相關性分析一覽表

表3 運動干預前后各指標變化一覽表

發(fā)現4周運動后BM I等形態(tài)指標及血壓均發(fā)生顯著變化，Na+K+-ATPase活性顯著增加，Ca2+Mg2+-ATPase活性雖有增加，但未呈顯著性水平，與運動后血脂指標顯著性改善不同的是，運動前后PS外翻量未呈顯著性下降，但已經出現下降趨勢，提示運動引起的膜脂變化滯后于血脂代謝的改善。

4 討論

Pubmed檢索僅發(fā)現兩篇關于肥胖組和正常對照組之間紅細胞膜 PS外翻量差異性對比的報道[12，13]，其中只有SoláE等[13]的研究發(fā)現，二者之間存在紅細胞膜 PS外翻量的顯著差異，而 Samocha-Bonet D等[12]卻并未發(fā)現組間差異，兩項研究的結果不同，可能與樣本量的大小有關。本研究雖然未設對照組，但比較不同肥胖度兒童少年各組之間PS外翻量的不同可見，輕度肥胖組PS外翻量與其他兩組肥胖者之間存在顯著性差異，HDL僅在輕度肥胖者和重度肥胖者之間存在顯著性差異，除此之外的其他血脂指標均未在不同肥胖組之間顯示出差異性。提示，在兒童少年肥胖的初期，PS外翻量可能比其他血脂指標對兒童少年肥胖的發(fā)展更敏感，而 HDL似乎要在肥胖程度較重時才能體現出敏感意義。這一結果說明，在肥胖的發(fā)展過程中，當兒童少年血脂水平尚在正常范圍之時，紅細胞膜脂質成分已經發(fā)生了異常變化。這一發(fā)現在肥胖兒童少年脂代謝變化的研究中尚屬首次，今后有待進一步研究論證。

已有研究分別發(fā)現，成年超重肥胖者[7]和兒童超重肥胖者[14]紅細胞膜 MDA增加，并與BM I呈正相關（P＜ 0.05)，證實超重肥胖會引起機體紅細胞膜氧化應激增加，認為氧化應激的增加是紅細胞膜PS外翻增加的一個可能機制[3]。氧化反應中自由基的生成能引起膜脂質過氧化，紅細胞膜脂質過氧化連同隨后發(fā)生的MDA增加，會使翻轉酶失活，這反過來會引起紅細胞膜 PS外翻的增加。另有研究[9]顯示，收縮壓和舒張壓與膜脂質過氧化反應參數呈正相關而與Na+-K+-ATPase的活性呈負相關，本研究中PS外翻與收縮壓相關性雖未達顯著性意義（P=0.07，表中未顯示)但相關系數為0.498，提示肥胖者PS外翻增加可能的確與氧化狀態(tài)有關，可能由于肥胖兒童少年血脂代謝的紊亂導致過氧化作用加強，其中間代謝產物作用于紅細胞膜磷脂中的磷脂酰絲氨酸（PS)，使膜磷脂的量與質變化從而導致膜脂雙層結構受到破壞。但本研究未發(fā)現PS與酶活性的直接相關，提示肥胖者 PS外翻增加的機制并不僅局限于酶活性的影響。

本研究中4周運動后肥胖兒童少年BM I、體脂％、WC及WHR非常顯著性降低（P＜0.01)，說明本次有氧運動干預對降低肥胖兒童少年全身體脂量、腰腹部脂肪及改善體形效果顯著。不僅如此，紅細胞膜 Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase酶活性增加，其中前者的增高達到顯著性水平，這與國內學者[4]對進行不同負荷訓練的大鼠紅細胞膜ATP酶活性的變化報道結果相似，說明雖然肥胖者和正常人紅細胞膜分子水平上對急性運動反應不同[6]，但肥胖人群膜Na+K+-ATPase酶活性對運動訓練也存在和正常人相似的生理性應激反應，其機制可能與運動引起膜Na+K+-ATPase酶的活化因素——細胞內鈉離子增多有關，運動時機體需氧量增加，二氧化碳產量相應增多，紅細胞代謝增強導致ATP消耗增多，從而使鈉離子流入細胞內，加強了大量鈉離子泵出細胞的過程，從而維持了膜內的離子跨膜梯度保持了正常的滲透壓。而Ca2+Mg2+-ATPase酶活性的變化對運動干預的反應不顯著，可能是因為該酶對運動產生的低氧刺激不敏感所致，也有可能是本次運動干預時間不夠長，不足以使其發(fā)生顯著性變化。

運動對肥胖兒童少年紅細胞膜 PS外翻量影響的研究從未有報道，本研究發(fā)現，在運動后血壓、TC、TG、LDL/ HDL等血脂及脂蛋白指標發(fā)生顯著性下降的同時，受試者膜PS外翻也呈下降趨勢，但與運動后血脂指標非常顯著性改善不同，運動前后 PS外翻量差異并未呈顯著性（P=0.056)，提示，運動引起的膜脂質代謝改善滯后于血漿中脂質變化，今后可以通過增加運動干預結束后一段時間內對被試進行分次紅細胞膜抽取，從而對膜中脂質情況跟蹤調查來驗證。筆者對該狀態(tài)形成的可能原因做以下推測：1)雖然本次有效的運動減肥干預使肥胖兒童少年降低了體重，從而改善了原本由于肥胖而引起的較高氧化應激狀態(tài)，但4周的有氧運動干預使肥胖兒童少年又面臨著新增加的氧化狀態(tài)，部分抵消了運動對 PS外翻改善的良好效應。一方面，如上文所述，肥胖引起的機體紅細胞膜氧化應激增加是膜 PS外翻增加的原因之一，SoláE等[13]發(fā)現，成人肥胖者控制飲食所致的體重下降后 PS外翻量也得到明顯改善，同時紅細胞膜MDA水平也下降，推測可能體重下降能改善肥胖者膜氧化壓力，從而改善了 PS外翻水平。本研究中，運動干預對實驗對象的減肥效果非常顯著，從而改善了原本由于肥胖而引起的較高氧化應激狀態(tài)，有利于膜 PS外翻的改善。另一方面，動物實驗[5]發(fā)現，無論是間歇訓練還是持續(xù)訓練，大鼠 PS外翻量均升高，人體實驗[2，3]也證實，無論是長時間遞增負荷運動，還是高強度無氧運動，運動后實驗對象的紅細胞膜 PS外翻量均增加，而膜Na+K+-ATPase酶活性降低，Na+K+-ATPase是廣泛存在于真核細胞膜上的內在蛋白，是一種需要磷脂（僅為PS)維持其活性的酶，說明由于疲勞積累和脂質過氧化增加會對紅細胞膜破壞增加，加重了紅細胞的老化，這與增加機體氧化應激狀態(tài)有關[10]。說明運動干預會造成新的氧化應激，在一定程度上增加了受試者的膜 PS外翻水平。2)膜脂質對血脂的依賴與血液中可能存在著的特殊蛋白質影響：由于紅細胞無脂蛋白受體，所以紅細胞膜成分生物合成途徑缺乏，膜脂質成分依賴于與循環(huán)脂蛋白的交換，膜脂成分與血脂成分處于動態(tài)平衡之中，脂蛋白和紅細胞之間任何凈轉移的方向都是由脂質構成決定的。研究發(fā)現[11]，血漿脂蛋白的組成在血管內代謝過程中是不斷變化的，特殊蛋白質、血脂轉運蛋白都會影響脂蛋白和細胞之間脂質轉移，這也是造成膜脂質變化未及血脂變化顯著且迅速的可能原因。3)膜脂質更新所需的ATP供給不夠：成熟紅細胞沒有線粒體氧化途徑，糖酵解是其獲得能量的基本過程，紅細胞生成的ATP一部分維持了紅細胞膜上的“鈉泵”和“鈣泵”運轉，一部分維持紅細胞膜脂質的不斷更新。本研究中運動后膜 Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase酶活性的變化提示，肥胖兒童少年能量代謝的提高尚不能及時更新膜脂質變化，可能與運動訓練持續(xù)時間不夠久有關。

5 結論

肥胖兒童少年紅細胞膜 PS外翻可能與氧化狀態(tài)有關，在脂代謝紊亂的初期階段，PS外翻可能比血脂指標更能體現肥胖的發(fā)展。有氧運動干預能顯著增加紅細胞膜Na+K+-ATPase活性，改善紅細胞膜 PS外翻水平，但后者對運動干預的效應滯后于血脂變化。

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