止喘湯對哮喘大鼠模型氣道重構(gòu)中MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響*

霍博雅，張占鋒

哮喘是嚴(yán)重影響人體健康的慢性呼吸道炎癥性疾病，其臨床特點(diǎn)是慢性進(jìn)行性和難以根治性。氣道重構(gòu)是氣道炎癥反復(fù)損傷和修復(fù)的結(jié)果，是造成哮喘患者不可逆氣道阻塞的重要原因［1］。目前，對于哮喘氣道重構(gòu)仍缺乏有效的治療方法。通過對哮喘大鼠模型氣道重構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-9(MMP-9/TIMP-1)比例可以作為一種顯示哮喘氣道組織破壞和修復(fù)之間平衡的標(biāo)志，采取措施抑制MMP-9的過度表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡可以干預(yù)氣道重構(gòu)［2］。本實(shí)驗(yàn)用大鼠哮喘模型觀察中藥對氣道壁結(jié)構(gòu)及MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響，探討中藥復(fù)方在哮喘氣道壁重構(gòu)中的作用、可能的機(jī)制以及存在的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑、儀器

8周齡SPF級雄性SD大鼠50只，體重200g±20g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑和藥品:卵清白蛋白(GradeIII OVA，sigmaA5378)，MMP-9、TIMP-1、IV型膠原多克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。黃芩和止喘湯:各取生藥500g，分別加8倍量的水，各提取2次，每次1h，過濾，常壓濃縮至500ml(遼寧醫(yī)學(xué)院三附院中藥制劑室)。西藥:BUD氣霧劑(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)國藥準(zhǔn)字H20030410，規(guī)格5ml:20mg)。JWC–201D超聲霧化器(遼寧鞍山市同信醫(yī)用儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將上述大鼠置于遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，觀察 7d，所有大鼠反應(yīng)正常，把大鼠隨機(jī)分為正常組、哮喘組、BUD組、黃芩組和止喘湯組5組，每組10只。

1.2.2 哮喘動(dòng)物模型的復(fù)制 參照Holgate等［1］的方法復(fù)制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的 OVA混懸液 1ml［內(nèi)含 OVA100mg、AL(OH)3100mg］致敏，自15d始分別將各組大鼠置于30×30×40cm有進(jìn)出兩口的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，1%OVA溶液霧化吸入，0.5ml/min，30min/次，1 次/d，共 6 周。中藥組:每次激發(fā)前30min中藥灌胃(按大鼠體質(zhì)量1ml/100g);BUD組:激發(fā)前30min生理鹽水灌胃及5ml:1mgBUD霧化吸入;哮喘組激發(fā)前30min生理鹽水灌胃;正常組腹腔注射、灌胃及霧化吸入以生理鹽水代替。以大鼠呼吸急促、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標(biāo)志。

1.2.3 取材及測定方法 各組動(dòng)物均于最后1次激發(fā)24h內(nèi)處死并收集肺組織標(biāo)本。取右肺中葉肺組織標(biāo)本4%的多聚甲醛固定后，進(jìn)行脫水、透明、垂直于氣道取材，石蠟包埋、切片、片厚 4μm。一部分切片按HE常規(guī)染色步驟染色。另一部分切片作免疫組化處理:采用SP法并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用微波抗原修復(fù)，各組分別滴加1∶200的一抗，陰性對照以PBS代替一抗，其余條件相同。染色判斷標(biāo)準(zhǔn):陰性為不著色，弱陽性呈淡黃色，陽性呈黃色，強(qiáng)陽性呈棕黃色和棕色。

1.2.4 氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)測量及免疫組化半定量分析 氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)測量:每組隨機(jī)抽取10張切片，每張切片選取3支直徑為200μm左右完整無斜切的小支氣管，參照文獻(xiàn)［3］關(guān)于氣道各層的定義，采用病理圖像分析系統(tǒng)測定各支氣管基底膜周徑(Pbm)、外壁面積(WAo)、內(nèi)壁面積(WAi)及氣道平滑肌面積 (WAm)，并用 Pbm將測量值標(biāo)準(zhǔn)化，以消除管徑大小、氣道狀態(tài)以及切片方向不同等所造成的差別，分別以 WAo/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm表示相應(yīng)管壁層的厚度。免疫組化半定量分析:隨機(jī)取10個(gè)視野，采用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件測定各組氣道壁 MMP-9、TIMP-1、IV型膠原含量(免疫組織化學(xué)染色陽性單位)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料以珋x±s表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，各計(jì)量數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，凡符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法。對不符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量數(shù)據(jù)，則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)(Kruskal– Wallis法)，多組間兩兩比較采用 Mann–Whitney U法。相關(guān)性分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

表1顯示，正常組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常，各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。哮喘組氣道黏膜水腫，黏膜皺襞增多，黏膜下及管周有大量的炎性細(xì)胞浸潤，氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多，細(xì)支氣管的氣道壁、平滑肌層及基底膜等明顯增厚，管腔變窄甚至閉塞。中藥組和BUD組較哮喘組上述改變明顯減輕。

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較(珋x±s，n=10)

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表2圖1顯示，正常組氣道黏膜上皮細(xì)胞、少量的間質(zhì)細(xì)胞及極少量的炎性細(xì)胞有微量的MMP-9及TIMP-1表達(dá);模型組氣道上皮細(xì)胞、氣道炎性細(xì)胞及氣道外壁的成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，部分棕黃色呈強(qiáng)陽性表達(dá);中藥組和BUD組較哮喘組顏色變淺，表達(dá)明顯減弱。IV型膠原在氣道壁上的表達(dá)情況與MMP-9及TIMP的表達(dá)趨勢相同。

表2 各組大鼠氣道MMP-9、TIMP-1及IV型膠原表達(dá)比較(珋x±s，n=10)

3.3 各組大鼠氣道壁厚度、IV型膠原與MMP-9、TIMP-1的相關(guān)性分析

大鼠氣道形態(tài)學(xué)各指標(biāo)及IV型膠原含量與MMP-9、TIMP-1呈正相關(guān)，與 MMP-9/TIMP-1呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和沉積失衡是導(dǎo)致呼吸道壁結(jié)構(gòu)異常構(gòu)建、肺實(shí)質(zhì)破壞及間質(zhì)增生的重要原因，而MMP則是調(diào)節(jié)ECM代謝的主要限速酶。氣道重構(gòu)的過程也是MMP在氣道壁沉積的過程，MMPs和TIMPs的平衡是維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的決定因素。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在MMPs中，MMP-9和 TIMP-1與哮喘氣道壁重構(gòu)有密切關(guān)系［2、4］。

圖1

哮喘氣道重構(gòu)是哮喘氣道結(jié)構(gòu)改變的簡稱，在形態(tài)上主要表現(xiàn)為氣道壁增厚、上皮細(xì)胞損傷、基底膜網(wǎng)狀層增厚、黏膜下膠原沉積、支氣管平滑肌增生、血管增生及外膜新血管形成［5］。氣道重構(gòu)在哮喘的早期或輕型哮喘即存在，并有研究認(rèn)為它是哮喘發(fā)病過程中的一個(gè)原發(fā)的病理表現(xiàn)［6］。氣道重構(gòu)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、促進(jìn)氣道炎癥的持續(xù)、產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抵抗及惡化肺功能，有學(xué)者認(rèn)為它可能是頑固性哮喘的病理學(xué)基礎(chǔ)［7］。氣道重構(gòu)一旦發(fā)生即難以逆轉(zhuǎn)，目前認(rèn)為激素對上皮下纖維化有一定作用，但隨著激素抵抗性哮喘增多，激素加重哮喘氣道重構(gòu)被報(bào)道［8］以及激素的全身副作用被重視，激素的應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)。

中醫(yī)認(rèn)為，哮喘的基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)證(宿痰內(nèi)伏、外邪觸發(fā)，肺脾腎虛是疾病的關(guān)鍵)，止喘湯(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶藶子、黃芩、丹參、川芎)是基于哮喘基本病機(jī)證型的復(fù)方，由定喘湯合四君子湯加減而成。全方具有補(bǔ)益肺脾腎、活血化瘀、清泄肺熱、祛痰止咳平喘功效，為根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的自擬中藥合劑，臨床應(yīng)用效果良好［9］。方中黃芩經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，對哮喘氣道炎癥、氣道高反性［5］和氣道重構(gòu)［10］有可靠作用。本實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)觀察中藥、BUD組均具有干預(yù)氣道重構(gòu)的作用，其中復(fù)方組肺纖維化程度要輕于單味組。各組MMP-9、TIMP-1的表達(dá)不同，高表達(dá)者氣道壁增厚明顯，且MMP-9、TIMP-1的表達(dá)及MMP-9/TIMP-1比值與IV型膠原表達(dá)、氣道壁厚度之間密切相關(guān)。表明中藥、BUD組可能通過抑制MMP-9、TIMP-1的過度表達(dá)，調(diào)節(jié) MMP-9/TIMP-1的平衡而干預(yù)哮喘氣道重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，中藥具有干預(yù)哮喘大鼠模型氣道重構(gòu)的作用，這些作用可能是通過抑制MMP-9、TIMP-1的過度表達(dá)、調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡而實(shí)現(xiàn)的。在療效上基于中醫(yī)基本病機(jī)證型的復(fù)方優(yōu)于單味中藥，此結(jié)果為復(fù)方治療哮喘的中醫(yī)辨證論治提供了現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)。

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